猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立*

李　春，宋云峰，金梅林^*，陈焕春

(华中农业大学动物医学院农业微生物国家重点实验室，湖北武汉 430070) 

摘　要：根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物，从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因，并将其克隆到原核表达载体pET­28a中，在大肠埃希菌中诱导表达。对表达蛋白进行SDS­PAGE和Western blot的结果表明，HA基因在大肠埃希菌中获得表达，产物具有免疫学活性，表达蛋白分子质量约为55 ku。表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法。该方法具有较高的特异性和敏感性，重复性良好。应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测，结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性，平均为20.5%。在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰，分别高达25.4%、25.0%和35.5%。

关键词：猪流感病毒；H1N1亚型；血凝素基因；间接ELISA 

猪流感(SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus， SIV)引起的一种以咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征的急性、高度接触性传染病。猪只不分年龄、性别和品种均能感染，发病率高而病死率低，是规模化养猪场存在且必须根除的群发性疾病之一。李海燕等指出猪流感突出的流行特点是常常以亚临床形式存在，并常激发其他呼吸道病原继发或混合感染，使猪群死亡率增加，难以控制。

猪流感的发生已有近百年的历史，世界各地均有该病的发生的相关报道。目前的研究发现，猪群中广泛流行的主要有猪H1N1、类禽H1N1和类人H3N2亚型毒株^[1­2]。猪流感在公共卫生学上具有重要意义，历史上每次人流感的大流行都与猪流感密切相关。李海燕等鉴于猪在“禽­猪­人”传播链中的中间宿主和多重宿主的作用，对我国猪群中猪流感的存在情况和潜在的公共卫生意义进行了探讨，我国目前对猪流感的研究还不能满足规模化养猪场对猪流感防控的需要。

2006年6月中上旬至8月间，我国南方地区暴发了无名“猪高热症”。该病传播速度快，发病率和病死率均较高。对于造成此病的原因众说纷纭，有的认为是由SIV引起的，混合或继发感染其他疾病；有的认为是由猪繁殖与呼吸综合征(Procine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)引起的，混合或继发感染其他疾病等^[3]。为了解SIV在我国的存在和流行趋势，分析SIV的流行规律，本研究利用H1亚型SIV HA基因的表达产物建立了间接ELISA检测方法，并对临床猪血清样品进行了抗体水平的检测。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　病毒和菌种　SIV H1N1亚型由华中农业大学农业微生物国家重点实验室分离保存。E.coli DH5α， E.coli BL21(DE)由华中农业大学农业微生物国家重点实验室保存和提供。

1.1.2　质粒及相关试剂　pMD18­T载体，AMV反转录酶，LA Taq聚合酶及相关限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA提取试剂盒购自Promege公司；UNIQ­10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；原核表达质粒pET­28a由本室保存。

1.1.3　血清和酶标抗体　猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒、猪传染性胸膜肺炎、猪伪狂犬、猪口蹄疫、猪瘟、猪细小病毒和H9亚型猪流感阳性血清由华中农业大学农业微生物国家重点实验室制备、提供，临床血清共2 584份(包括湖北、湖南、安徽、江西、河南、山西)。辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG购自晶美生物公司。H1N1亚型猪流感抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司。

1.2　方法

1.2.1　引物设计　根据H1N1亚型猪流感病毒已测出的序列和GenBank收录的相关序列分析，设计并合成引物PHA1和PHA2用于扩增缺失了信号肽和跨膜区的HA基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列分别为：

PHA1：CG GGA TCC GAC ACA ATA TGT ATA(引入BamHⅠ酶切位点)

PHA2：CGC AAG CTT TG ATA GAC TCC CAT(引入HindⅢ酶切位点)

1.2.2　RT­PCR　参照Promege提取RNA说明书中的方法从第5代尿囊液中提取病毒RNA，作为模板。RT­PCR参考文献[4]进行。

1.2.3　HA基因的克隆和亚克隆　PCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收连接到pMD18­T载体中。按照分子克隆中提供的方法转化。经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定含有正确插入片断的重组质粒进行测序，并命名为pTHA。将pTHA用BamHⅠ＋HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET­28a上。经PCR和BamHⅠ＋HindⅢ双酶切鉴定为阳性克隆子后进行测序，并命名为pETHA。

1.2.4　重组表达质粒诱导表达与表达产物的检测　诱导表达和表达产物的提取按Novagen公司的pET­28a表达系统操作手册进行。表达产物的SDS­PAGE和Wester blot均按文献[4]进行。

1.2.5　表达产物的纯化　纯化方法按pET­28a纯化说明书进行，将诱导表达的菌体收集后超声波破碎，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，加入到已平衡好的Ni^＋柱中。经过多次洗脱，收集洗脱液，即为含有目的蛋白的纯化液。

1.3　间接ELISA方法的建立

1.3.1　最佳抗原包被浓度　通过方阵滴定来决定抗原包被浓度和血清最佳稀释浓度。抗原从1∶10、1∶20稀释到1∶1 280，阳性血清从1∶10、1∶20稀释到1∶320，阴性血清稀释倍数如阳性血清。按间接ELISA方法进行，用酶标仪测OD₆₃₀值，以阳性OD₆₃₀值/阴性OD₆₃₀值(P/N值)最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释浓度为最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度。

1.3.2　判定标准的确定　将临床经血凝抑制试验(HI)检测为阴性的55份猪血清，进行ELISA检测均为阴性，计算55份血清的平均值 ，标准差(standard deviation，SD)，阴阳界限确定的计算公式为 ＋2SD。

1.3.3　重复性试验　用同时包被和不同时间包被的酶标板对不同抗体水平的血清样品(包括10份阳性血清，10份阴性血清)进行批内和批间重复性检测，按照参考文献[5]进行，计算批内和批间的变异系数。

1.3.4　特异性试验　分别检测猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪传染性胸膜肺炎、猪伪狂犬病、猪口蹄疫、猪瘟、猪细小病毒病和H9亚型猪流感阳性血清。

1.3.5　敏感性试验　选择常规检测方法即HI与本研究建立的间接ELISA方法相比较来确定该ELISA方法敏感性。

1.3.6　间接ELISA和IDEXX试剂盒的对比试验　IDEXX的H1N1亚型猪流感ELISA试剂盒使用方法按说明书操作，与本研究建立的方法同时检测临床送检的94份血清。

1.3.7　间接ELISA的临床应用　用此ELISA方法检测来自湖北、湖南、安徽、江西、河南和山西的临床血清，共计2 584份。

2　结果

2.1　HA基因的RT­PCR

RT­PCR扩增产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增出约为1 500 bp大小的特异性片段，与预期的结果相符(图1)。

2.2　HA基因的克隆和亚克隆

RT­PCR扩增产物经8 g/L胶回收纯化后与pMD18­T载体连接，转化E.coli DH5α。经BamHⅠ＋HindⅢ双酶切鉴定获得约1 500 bp和2 700 bp左右的两个条带，与预期的结果相符。

1.DNA标准 DL 2 000；2.RT­PCR产物

1.DNA Marker DL 2000；2.RT­PCR products

图1　RT­PCR扩增HA基因的产物

Fig.1　RT­PCR products of HA gene  

将pTHA经BamHⅠ＋HindⅢ双酶切后的产物连接到pET­28a中，经BamHⅠ＋HindⅢ双酶切鉴定获得约1 500 bp和5 000 bp左右的两个条带，与预期的结果相符(图2)。

1.DNA标准 DL 15 000；2. pET­28a载体；3. pETHA经BamHⅠ＋HindⅢ双酶切产物；4.DAN标准 DL 2 000

1.DNA Marker DL 15 000； 2.pET­28a； 3.pETHA/BamHⅠ＋HindⅢ； 4. DNA Marker DL 2 000

图2　重组表达质粒pETHA酶切结果

Fig.2　Identification of recombinant expression plasmid pETHA 

2.3　表达产物SDS­PAGE和Western blot

含pETHA的重组质粒在E.coli BL21中表达出约55 ku的蛋白带，而pET­28a载体对照在55 ku

处没有明显表达带(图3)。Western blot结果显示55 ku的蛋白带与兔抗H1亚型阳性血清发生特异性的免疫反应，以上结果说明目的基因获得表达，并具有良好的反应原性(图4)。

2.4　间接ELISA方法

2.4.1　ELISA最适抗原包被浓度和血清稀释浓度的确定　方阵滴定结果显示，抗原最佳包被浓度为1∶320，即0.066 μg/孔，血清最佳稀释浓度为1∶40。

2.4.2　阴、阳界限的确定　根据55份阴性血清计算平均值为0.15，标准偏差为0.047。即 OD₆₃₀>0.244时可判定为阳性，OD₆₃₀<0.244判定为阴性。

2.4.3　重复性试验　取相同批次和不同批次包被的酶标板检测20份不同抗体水平的猪血清结果显示批内重复吸收变异系数在4.0%～7.5%之间，批间重复吸收变异系数在3.5%～6.0%之间，说明该诊断方法具有良好的重复性。

2.4.4　特异性试验　检测猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪传染性胸膜肺炎、猪伪狂犬病、猪口蹄疫、猪瘟、猪细小病毒病和H9亚型猪流感阳性血清均无交叉反应。说明该方法的特异性好，结果见表1。

2.4.5　敏感性试验　选择HI与本研究建立的间接ELISA方法相比较做血清盘来说明，结果见表2。结果显示，敏感性为90.3%(28/31)。

1.pETHA诱导表达产物；2.pET­28a载体对照；3.蛋白分子质量标准

1.pETHA；2.pET­28a；3.Protein MW Marker　

图3　重组质粒pETHA诱导表达产物的SDS­PAGE检测

Fig.3 SDS­PAGE analysis of the expressed protein of pETHA

1.2.pETHA表达产物；3.预染的蛋白分子质量标准

1.2.pETHA；3.Prestained Protein MW Marker

图4　重组质粒pETHA表达产物的Western blot检测

Fig.4　Western blot of the expressed protein of pETHA

表1　特异性试验

Table 1　The specificity test

表2　敏感性试验

Table 2　The sensitivity test

2.4.6　间接ELISA与进口试剂盒对比试验　选择94份血清同时用两种方法进行比较，结果显示符合率为77%(71/92)。

2.4.7　间接ELISA的临床应用　试验结果显示，在临床2 584份血清样品中，检测出阳性率为20.5%。对2006年不同月份检测结果如图5。

图5　2006年不同月份检测H1亚型猪流感抗体结果

Fig.5　The results of H1 subtype of swine influenza in different months of 2006 

3　讨论

HA基因在A型流感病毒中同源性较低，保守性弱，但在同一亚型中具有较高的同源性，同时能够诱导特异性抗体产生，因此，可以利用HA蛋白建立一种检测H1亚型SIV的方法^[6]。本研究试图表达HA全基因，但是重组质粒经过诱导发现无明显蛋白表达。利用基因工程手段将HA基因的信号肽和跨膜区去掉后进行诱导表达，结果表明该重组表达质粒在E.coli BL21中高效表达。这种差异可能是由于载体启动子及表达产物的后加工引起的。表达的蛋白主要集中于包涵体中，通过Western blot发现该包涵体无良好的抗原性，活性不高，无法用于诊断抗原。为了获得良好抗原性和高活性的蛋白，我们探索了诱导时间、温度和IPTG诱导浓度改变后使HA蛋白部分的分泌在上清中，利于纯化。例如，降低IPTG的浓度使目的蛋白在低浓度的诱导剂环境中表达，可以使蛋白分泌到上清中但是总含量很少。进一步我们将诱导温度降至30 ℃，诱导3 h～4 h，通过SDS­PAGE发现蛋白约有一半分泌到上清中。Western blot结果显示分泌到上清中的蛋白较在包涵体中的蛋白具有良好的抗原活性，这是制备包被抗原的重要因素之一。

采用HA蛋白作为包被抗原建立了检测H1亚型SI抗体的间接ELISA方法，可以直接鉴定亚型，省时，节约资源。该方法特异性好，与常见的猪传染病之间均无交叉反应。而且本研究中建立的ELISA方法操作简单，结果可靠，适用于H1N1猪流感的血清流行病学调查。

2006年5月以来的流行病学调查表明，从6月至7月检测猪群中流感病毒抗体阳性率高达25.4%，在8月稍有回落。这些结果说明，在2006年6月之前猪群中可能出现过H1亚型猪流感的流行，使部分猪群感染，体格健壮的猪群能够诱导产生高水平的抗体，而体弱或本来就有疾病的猪群感染SIV后无法恢复健康，从而导致随后继发感染其他疾病而大量死亡，所以在8月以后调查结果显示抗体水平下降。流行病学检测结果与杨得胜等^[7]在2006年5月间检测的数据相当。而孙彦伟等^[8]报道2006年5月～7月广东部分规模猪场流感病毒抗体平均阳性率达到46.09%，某些猪场甚至高达90%以上。这可能是因为各地选择了本地区分离毒株作为抗原进行检测，检测结果应做进一步分析。

本次试验结果显示出猪流感是猪场普遍存在猪流感的猪传染病之一，由于SIV在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有举足轻重的地位，具有重要的公共卫生学意义。因此，了解猪流感的感染情况，不仅可为促进养猪的健康发展提供制定防控计划的科学依据，也是防控人流感的重要环节。

参考文献（略）