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JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10线粒体膜电位检测试剂盒
产品信息
产品货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
FS1169-100T | JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 | 100T | 1600.00 |
产品描述
线粒体膜电位荧光探针JC-10是JC-1的升级产品,同样可用于检测线粒体膜电位的变化。因JC-1虽然在许多实验中被广泛应用,但是其水溶性很差,即使在1 μM浓度的条件下,JC-1也会在水的缓冲液中析出。而JC-10具有更好的水溶性,可以在某些需要高浓度染料的实验中替代JC-1。虽然在一些细胞系中JC-10有着比JC-1更好的表现,不过,JC-10的性能表现极具细胞依赖性特征。
正常细胞内,JC-10选择性聚集在线粒体基质中形成可逆的红色荧光聚合物(Ex=540 nm, Em=590 nm);不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失,JC-10由多聚体转变为单体形式存在于胞浆中,产生绿色荧光(Ex=490 nm, Em=525 nm)。JC-10不仅可用于定性检测,因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测,因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。这两种颜色的变化可以用流式细胞仪上的标准滤光器检测到,绿色荧光可用FL1通道分析,红色荧光可用FL2通道分析。除了用于流式细胞术,也可以用于荧光成像和荧光酶标板检测平台。
本试剂盒中提供了阳性对照CCCP,其能诱导线粒体膜电位下降。对于六孔板中的样品,本试剂盒共可以检测100个样品。
产品组分
编号 |
组分 |
规格 |
FS1169-A |
JC-10(200×) |
100 μL×5 |
FS1169-B |
CCCP(10 mM) |
20 μL |
FS1169-C |
JC-10染色缓冲液(5×) |
80 mL |
FS1169-D |
超纯水 |
90 mL |
运输与保存方法
冰袋(wet ice)运输。-20℃干燥避光保存,分装,以避免反复冻融,一年有效。超纯水和JC-10染色缓冲液(5×)也可4℃保存。
使用方法
1. JC-10染色工作液的配置
取适量JC-10(200×),按照每50 μL JC-10(200×)加入8 mL超纯水的比例稀释,剧烈震荡充分溶解并混匀JC-10,然后再加入2 mL JC-10染色缓冲液(5×),混匀后即为JC-10染色工作液。
2. 阳性对照的设置
取出试剂盒中供的CCCP(10 mM)按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中,使其终浓度为10 μM,处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载JC-10,进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞,通常10 μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失,JC-10染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-10染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞,CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料决定。
3. 细胞染色
3.1对于悬浮细胞
1)取1×105~6×105个细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中(可以含血清和酚红),加入0.5 mL JC-10染色工作液,颠倒混匀。
2)37℃孵育20分钟。孵育期间,按每1 mL JC-10染色缓冲液(5×)加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液(1×),并置于冰浴,作为洗液。
3)37℃孵育结束后,600g 4℃离心3~4分钟,弃上清,注意尽量不要吸除细胞。加入1 mL JC-10染色缓冲液(1×)重悬细胞,600 g, 4℃离心3~4分钟,弃上清,重复一次。
4)用适量JC-10染色缓冲液(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
3.2对于贴壁细胞
1)对于6孔板,吸除培养液,根据具体实验如有必要可用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入1 mL细胞培养液(可
以含血清和酚红)。
2)然后加入1 mL JC-10染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。孵育期间,按每1 mL JC-10染色缓冲液(5×)加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液(1×),并放置于冰浴,作为洗液。
3)37℃孵育结束后,吸除上清,用JC-10染色缓冲液(1×)洗涤2次。
4)加入2 mL细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
【注】:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,可以先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
3.3对于纯化的线粒体
1)把配制好的JC-10染色工作液用JC-10染色缓冲液(1×)稀释5倍。取5倍稀释的JC-10染色工作液0.9 mL 加入0.1 mL总蛋白量为10~100 μg纯化的线粒体。
2)用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan),激发波长为485 nm,发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm时,可以在475~520nm范围内设置激发波长。
4. 荧光观测
检测JC-10单体时可以把激发光设置为490 nm,发射光设置为530 nm;检测JC-10聚合物时,可以把激发光设置为525 nm,发射光设置为590 nm。
【注】:此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在zui大激发波长和zui大发射波长。如使用荧光显微镜观察,检测JC-10单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置,如观察GFP或FITC时的设置;检测JC-10聚合物时可以参考观察其它红色荧光,如碘化丙啶或Cy3时的设置。
注意事项
1)JC-10(200×)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以20~25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
2)须把JC-10(200×)用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后才可加入JC-10染色缓冲液(5×)。不可先配制JC-10染色缓冲液(1×)再加入JC-10(200×),否则JC-10将很难充分溶解并会严重影响后续的检测使用。
3)使JC-10染色缓冲液(1×)保持4℃左右,此时的洗涤效果较好。
4)JC-10探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测过程。在检测前需冰浴保存。
5)请勿把JC-10染色缓冲液(5×)全部配制成JC-10染色缓冲液(1×),本试剂盒使用过程中需直接使用JC-10染色缓冲液(5×)。
6)如果发现JC-10染色缓冲液(5×)中有沉淀,必须全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在37℃加热。
7)CCCP为线粒体电子传递链抑制剂,有毒,请注意小心防护。
8)为了您的an全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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