应用HPLC二手高效液相色谱仪检测咖啡因法对戒毒新药冰茶栓中咖啡因含量的测定方法，样品经1∶1的乙醚－石油醚溶化，用1∶1的甲醇水溶液提取，用20 mmol／l醋酸铵缓冲液和甲醇（80∶20）作为流动相，经ODS－C18柱分离，紫外270 nm检测，加标平均回收率为98．22％，相对标准偏差（CV）日内为0．30％，日间为0．97％，最低检出浓度为25μg／L，最低定量浓度为100μg／L，线性范围为10～250μg／mL，相关系数为0．999 9。
    关键词：二手高效液相色谱仪检测咖啡因；Waters2695+Waters2996；咖啡因。
    目前，常用的咖啡因含量测定方法有紫外分光光度法二手高效液相色谱仪检测咖啡因［HPLC］等。紫外分光光度法虽然简便、快速，但当样品中含有270 nm附近具有紫外吸收的杂质时，可产生较大的误差，使结果偏高；用高效液相色谱法测定各种饮料中的咖啡因已有许多报道，但冰茶栓作为一种新药，测定其中的咖啡因还未见报道。
　　冰茶栓为一种具有戒毒效果的复方栓剂，内含桂皮醛、咖啡因、冰片和微量蛇毒蛋白，本栓剂的填充剂为单甘酯，占总量的90％以上，而咖啡因只占总量的6％。本文的关键在于试样的前处理方法，要找到一种既能完全提取试样中的咖啡因，又能去除试样中的其他组分的方法。由于单甘酯不溶于水、甲醇、乙腈等强极性溶剂，易溶于乙醚、石油醚等弱极性溶剂中，而咖啡因正相反。根据该试样的实际情况，本文利用试样中各组分的极性差异，样品用乙醚－石油醚（1∶1）溶化后，再用1∶1的甲醇水溶液提取其中的咖啡因，用C18柱进行分离，用紫外检测器进行检测。文中对检出限和定量限、标准曲线、方法回收率、系统精密度、方法精密度及系统干扰性试验均作了验证。
1　试验部分
1．1　仪器与试剂
   二手高效液相色谱仪检测咖啡因，带Waters2996二极管阵列检测器；超声波清洗器。
　　试剂　乙醚（AR级）；石油醚（AR级，30～60℃）；甲醇（AR级）；重蒸水；咖啡因标准品。
1．2　色谱条件(二手高效液相色谱仪检测咖啡因)
　　色谱柱：C18柱，250mm×4．6 mm；流动相A：0．02 mol／L醋酸铵水溶液；B：甲醇。A∶B＝80∶20；流速：1 mL／min；检测波长：270 nm；进样量：20 uL；数据运行时间：20 min。
1．3　样品处理
　　准确称取试样一颗（约2．5 g）于150 mL的小烧杯中，加入100 mL的乙醚－石油醚（1∶1），于超声波振荡器中超声10 min，待试样溶化后，转入250 mL的分液漏斗中，用1∶1的甲醇水溶液150 mL分3次萃取，收集下层溶液于250 mL的容量瓶中，并用1∶1的甲醇水溶液定容至刻度。摇匀后分取5 mL该溶液于50 mL的容量瓶中，用水定容至刻度。过0．3μm的滤膜，取滤液进样。
2　结果与讨论
2．1　二手高效液相色谱仪检测咖啡因咖啡因的检出限和定量限
　　将3倍于基线噪音的信号确认为峰，此时的溶液浓度为该组分的检出限。当峰高10倍于基线噪音且六次重复进样峰面积相对标准偏差（RSD）均小于10，此时的溶液浓度为该组分的最低定量限。以此为条件，将咖啡因标准品浓度以3倍信噪比浓度为起点，用流动相稀释至0．025μg／mL和0．10μg／mL，分别重复进样六次。

2．2　标准曲线的制作
　　二手高效液相色谱仪检测咖啡因分别吸取1．0 mg／mL的咖啡因标准储备液100，250，500，1 000，2 000，2 500μL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。依次重复进样3次，得线性回归方程为Y＝5．42 X＋6．8，相关系数R＝0．998。标准色谱见图1。

2．3　方法回收率试验
　　称取2．66 g试样12份，在试样中加入相当于试样浓度的50％，70％，100％，120％，150％的咖啡因标准溶液，按照与试样相同的方法处理，在上述五点重复两次，取其平均浓度求得各点的平均回收率，平均回收率可达98．22％。
2．4　重现性的试验
2．4．1　系统精密度试验
　　制备试样一份，日内重复六次进样，日间重复六天进样。由表2可知，日内精密度为0．30％，日间精密度为0．97％，表明系统精密度良好。

2．4．2　二手高效液相色谱仪检测咖啡因方法精密度试验
　　重复取样五份，按上述方法处理试样后，依次进样，每份重复进样两针。测得样品中咖啡因的平均含量为55．45 mg／g，相对标准偏差为3．99。样品色谱图见图2。

2．5　二手高效液相色谱仪检测咖啡因方法选择性试验
　　取相当量的药栓填充物单甘酯，桂皮醛，蛇毒，冰片与试样相同方法处理，色谱图见图3。可见，这些成分对测定没有干扰。
3　小结
　　本方法适合于复杂样品中咖啡因的测定，操作简便，快速，灵敏度高。经验证，加标平均回收率为98．22％，变异系数（CV）日内为0．30％，日间为0．97％，最低检出限为25μg／L，最低定量限为100 ug／L，线性范围为10～250μg／mL，相关系数为0．999 9。
参考文献：国家标准GB／T16344—1996，二手高效液相色谱仪检测咖啡因。