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1. 原理
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞内的相应抗原(或抗体)。在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,荧光素受激发光的照射,由低能态进入高能态,而高能态的电子是不稳定的,以辐射光量子的形式释放能量后,再回到原来的低能态,这时发出明亮的荧光,利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术分直接法、间接法和补体法,最常见的为间接法。
2. 常见荧光素特性
(1)异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)
黄色结晶粉末,吸收光:490-495 nm,发射光:520-530 nm,明亮的黄绿色荧光。
(2)藻红蛋白(phycoerythrin,PE)
吸收光:490-560 nm,发射光:595 nm,红色荧光。
3. 实验步骤
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3 min;
(2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min, PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
(3)用0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
(4)PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
(5)在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30 min;
(6)吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜;
(7)PBST 浸洗爬片3次,每次3 min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1 h;
(8)PBST浸洗切爬片3次,每次3 min;
(9)滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行复染核,PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI;
(10)用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片;
(11)在荧光显微镜下观察。
4. 注意事项
(1)荧光染色后一般在1 h内完成观察,或于4℃保存4 h,时间过长,会使荧光减弱;
(2)每次试验时,需设置以下三种对照:
阳性对照:阳性血清+荧光标记物
阴性对照:阴性血清+荧光标记物
荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
(3)标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥;
(4)一抗和二抗应始终保持在标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。
服务项目
收费标准
样本要求
备注
细胞样本免疫荧光(ICC)---单标
140元/样本/指标
固定后的细胞爬片
客户提供一抗,本价格包含拍照及染色,不包含特殊分析
注意事项:
1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上;
2.取材切面要平整,厚度不宜超过2mm;
3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。
武汉华联科生物技术有限公司
公司电话:400-990-9795公司传真:
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- 询价产品:细胞样本免疫荧光(ICC)---单标
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