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订货号: | R1111 |
产品名称: | 黄曲霉毒素M1检测试剂盒 |
产品英文名称: | Aflatoxin M1 |
包装: | 96次检测 |
产品介绍: | 如下 |
产品说明: | 采用竞争酶标免疫法定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1,孵育时间1小时 |
黄曲霉毒素M1检测试剂
RIDASCREEN? Aflatoxin M1
简介
RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15产品编号: (R1111)
采用竞争酶标免疫法定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。
试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔(包括标准试验)
如果进行定量分析,必须有微孔板酶标仪。
(中文翻译件仅供参考,以试剂盒内附的英文原件为准)
样品制备
牛奶:脱脂
奶粉:还原、脱脂
奶酪:提取、离心
时间要求:(以10个样品为例)
牛奶/奶粉………………………….…….…….…大约0.5小时
奶酪………………………………….….………….大约2小时
孵育时间时间……………………….….………….大约1小时
检测下限
牛奶/奶粉:5ppt
奶酪:50ppt
回收率
牛奶:大约95%
奶粉:大约95%
奶酪:大约102%
交叉反应
黄曲霉毒素M1………………………………………….100%
黄曲霉毒素M2…..……………………………………….30%
1. 产品用途
RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15试剂盒利用竞争性酶免疫分析方法,用于定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。
2. 概述
黄曲霉毒素是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代谢产物,能致癌,高毒。
黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢产物。经摄入含有黄曲霉毒素B1饲料的奶牛产出的牛奶中,其中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定,巴氏灭菌法也无法将其杀灭,所以检测黄曲霉毒素M1不仅要在饲料原料中检测,而且在最终产品中也需要进行鉴定。自1999年一月开始,欧盟就制定了黄曲霉毒素残留的检测限,黄曲霉毒素M1的检测限为0.05 μg/l (50 ppt)。
使用RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15可以精确定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。
3. 测定原理
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素M1的特异性抗体。加入标准或样品溶液和在洗板后加入黄曲霉毒素酶标记物,游离黄曲霉毒素M1与黄曲霉毒素M1酶标记物竞争结合黄曲霉毒素M1抗体的结合位点(竞争性酶免疫分析方法)。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量,吸光值与样品中黄曲霉毒素M1浓度成反比。
4. 提供的试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个测量(包括标准测定孔)
盒中的材料如下:
1×96孔板(12条 X 8孔)包被有黄曲霉毒素M1抗体
6×黄曲霉毒素M1标准液,1.3 ml/瓶
浓度为:0 ppt, 5 ppt,10 ppt,20 ppt,40 ppt,80 ppt
黄曲霉毒素M1的牛奶缓冲液
1×酶标记物(1.3ml)……………………………….红色帽
过氧化物酶标记物的黄曲霉毒素M1
1×底物/发色剂(12ml)…………………………….. 蓝色帽
微红色,包含四甲基苯醌
1×反应停止液(14ml)...….…………………... ……黄色帽
为1N硫酸
1×缓冲液1(20ml)
样品稀释缓冲液
1×缓冲液2(12ml)...….…………………... …….…白色帽
酶标记物稀释缓冲液
1×洗涤缓冲液
为10Mm的磷酸缓冲液(pH7.4),包含0.05%的Tween20
5. 需要的材料但盒中不提供
5.1设备
----微孔板酶标仪(450nm)
----离心机
----巴氏吸液管
----刻度吸量管
----50ul,100ul,400ul微量加样器
----只用于奶酪检测
----振荡器
----蒸发器
5.2 试剂
----甲醇
----n-庚烷
----二氯甲烷
----PBS-缓冲液,pH 7.2:
0.55g NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸馏水至1000ml
6. 操作者应该注意之事项
----标准液含有黄曲霉毒素M1(致癌),要特别小心,应戴手套,避免试剂接触皮肤
----使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液(10%V/V)浸泡过夜
----反应停止液为1N硫酸,避免接触皮肤
----不要使用过了有效日期的试剂盒,稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低
----不要交换使用不同批号的盒中试剂
7. 储存条件
----保存试剂盒于2-80C。不要冷冻
----将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封
----标准物质对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下
----无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下
8. 试剂变质的迹象
发色试剂若显色表明发色剂变质,应当弃之。
0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时,表示试剂可能变质。
9. 样品处理
9.1. 牛奶
----取牛奶样品,用冷冻离心机(3500g ,10℃)离心10分钟去除脂肪
(如没有冷冻离心机,可将样品先冷却到10℃,再离心)
----离心后用巴氏吸液管彻底去除上层奶油。
----取脱脂牛奶用于检测(每孔100μl)
9.2. 奶粉
----用天平称取10g奶粉到容量瓶加去离子水到100ml。
(还原牛奶)
----震荡5分钟,使充分溶解。
----按照9.1牛奶样品处理步骤进行
9.3. 奶酪
代表性的样品应该研磨,充分混合。整个均质过程不要加入任何液体。
如果奶酪表面呈现出不同状态,则不要取奶酪表面作为样品,否则将影响检测结果。
----称取2 g研磨过的奶酪,装入玻璃离心管中。
----加入40ml二氯甲烷,放在振荡器上震荡15分钟。
----过滤后取10ml滤液60 °C氮气吹干
----将吹干残留的油状物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS缓冲液(参见5.2.)和1 ml庚烷充分混合溶解。
----离心: 15分钟 / 2700 g / 15 °C
----完全除去上层庚烷层。
----用巴氏移液管小心移取部分甲醇水层
----取100 μl甲醇水层用400 μl缓冲液1稀释成为含10%甲醇的溶液
----每孔用100 μl进行检测。
备注:如果需要进一步稀释溶液,则使用缓冲液1进行稀释。
10. 酶标免疫分析程序
10.1测定之前注意事项
1. 用之前将所有试剂回升至室温(20-25℃)。
2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3. 在使用中不要让微孔干燥。
4. 在EIA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。
5. 在所有孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔板。
10.2 黄曲霉毒素M1酶标记物
Aflatoxin M1 酶标记物(红帽)为浓缩液。由于稀释了的酶标记物稳定性不好,因此只稀释需用量的酶标记物。稀释前酶标记物应轻轻振荡混匀。酶标记物用缓冲液2(白帽)以1: 11的比例稀释(400 μl浓缩液+ 4.0 ml 缓冲液,足够4个微孔板条32孔检测)
10.3 洗涤缓冲液
在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂,一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中,制备好的洗涤缓冲液在4oC条件下可以保存4周。
10.4 包被有抗体的微孔板条
锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-80C。不要冷冻。
10.5 测定程序 (在20-25 oC条件下操作)
1.将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准及样品做平行,并记录标准及样品的位置。
2. 加入100ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中,轻轻震板混合,在室温(20-25 oC)暗处孵育30分钟。
3.倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液(见10.3)再次倒出孔中的液体,完全除去孔中的液体,重复操作洗涤步骤两次以上。
4.加入100ul酶标记物(红色帽)到微孔底部,轻轻震板混合,在室温(20-25 oC)暗处孵育15分钟。
5.倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液(见10.3)再次倒出孔中的液体,完全除去孔中的液体,重复操作洗涤步骤两次以上。
6.加入100ul底物/发色剂到微孔中,混合后在室温(20-25 oC)暗处孵育15分钟。
7.加入100ul反应停止液到微孔中,混合好在450nm处测量吸光度值,以空气为空白,15分钟内读取光度值。
11. 结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 (0标准) 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
标准的吸光度值(或样品)
────────────── × 100= %吸光度值
0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素M1浓度(ng/l)的半对数坐标系统曲线图,校正曲线在10-40 ng/l (ppt)范围内应当成为线性,相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
为了得到样品中黄曲霉毒素M1的含量(ng/l),在标准曲线上读取的浓度必须乘以相应的稀释倍数。样品的稀释倍数如下:
牛奶/奶粉........................…………………….................1
奶酪....................................................……………….... 10
R-Biopharm开发出用于计算ELISA试剂盒检测结果的专用软件RIDA? SOFT,可以向当地分销商索取该软件。
12. 灵敏度
RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15试剂盒的最低检测下限为大约5 ppt,按照样品处理记录,牛奶、奶粉的检测限为5 ppt,奶酪的检测限为5 0ppt。
13. 特异性
RIDASCREEN?黄曲霉毒素M1 30/15试剂盒的特异性通过对相应的霉菌毒素交叉反应性分析而得到:
交叉反应:黄曲霉毒素M1....................................... 100 %
黄曲霉毒素M2.........……......................... 30 %
14. 再现性
由三个不同的实验结果确定了室内精密度,图2显示出RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15试剂盒的精密度情况,获得的标准吸收值的变异系数(%CV)对相应黄曲霉毒素M1浓度作曲线,可以看到在全部范围内变异系数如此之低,可以得到很好的再现性。
15. 回收率
牛奶的回收率大约 95 % ,平均变异系数约14 %。
奶酪的回收率大约为102 % ,平均变异系数大约为11 %。
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