T-2毒素检测试剂

酶联免疫分析定量测定T-2毒素试剂盒。德国R-Biopharm制造 （中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）

RIDASCREEN T-2 Toxin （产品编号：R3801）

简介

竞争酶标免疫法定量测定谷物及饲料中的T-2毒素。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。

样品提取：………………………………………………甲醇提取

检测时间：样品处理（以检测10个样品为例）

谷物和饲料…………………………………约30min

检测时间……………………………………约1.5h

检测限：…………………………………………………< 5ppb

回收率：…………………………………………………约90%

交叉反应：

1. 用途

RIDASCREEN T-2 Toxin竞争酶标免疫法定量测定谷物及饲料中的T-2毒素。

2. 概要

T-2毒素是由三线镰刀菌产生的代谢物，也是自然界最早发现的单端孢霉烯族化合物毒素。T-2毒素经常会在农作物中发现，而且分布的范围及产生的浓度范围都很宽。T-2毒素会对人及动物产生细胞毒性和免疫抑制作用。

目前，检测饲料及食品中的T-2毒素主要是采用HPLC、DC 及GC三种检测方法，但是这些方法制备样品费时又费力并且需要昂贵的仪器设备及专业的技术培训，而使用RIDASCREEN T-2毒素检测试剂盒则能够给你提供快速而准确的分析。

3. 测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG的羊抗体。加入T-2 毒素抗体，酶标记物，标准或样品溶液。游

离的T-2 毒素与酶标记物竞争T-2 毒素抗体，同时T-2 毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去，将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后，使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。

4.  提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下

1× 96孔板（12条 ×  8孔）包被有抗兔IgG的羊抗体

6× 标准液，1.3ml/瓶，为T-2 毒素标准溶液

标准液浓度为：0ppb，0.1ppb，0.2ppb，0.4ppb，0.8ppb，1.6ppb

1×  T-2 毒素抗体溶液（5ml）鼠单克隆，直接使用…..黑色帽

1×  酶标记的T-2 毒素，直接应用液（5ml）...…….…红色帽

1×  基质（7ml）...….……….…………….………………绿色帽

1×  发色剂（7ml）...….……….…………………….…....蓝色帽

1×  反应终止液，1N硫酸（14ml）...….……………..….黄色帽

1×  样品稀释缓冲液（50ml）

5.  需要的材料但盒中不提供

5.1设备

－－－－酶标仪（450nm）定量分析用

－－－－粉碎机

－－－－滤纸或是离心机

－－－－磁力搅拌器

－－－－50?l，100?l，500?l，1000?l微量移液器

5.2 试剂

－－－－甲醇

－－－－pH值为7.2的样品稀释用磷酸盐缓冲液 （PBS缓冲液）： 0.55 g NaH2PO4 × H2O + 2.85 g Na2HPO4 × 2 H2O + 9 g NaCl；用蒸馏水定溶至 1000 ml

注：如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于1：7），应向此缓冲液中加入10%的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为10%。（见9.1）

6. 操作者应该注意之事项

－－－－标准液含有T-2 毒素，应特别小心，避免接触皮肤（试验时要戴手套）。

－－－－使用过的玻璃容器及T-2 毒素溶液最好用pH 7（用HCl调整）的次氯酸钠溶液（10%（V/V））浸泡过夜

－－－－反应终止液为1N硫酸，避免接触皮肤

－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起   灵敏度的降低

－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂

7. 储存条件

－－－－保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻。

－－－－无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

－－－－将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封

8. 试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位（A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质）

9. 样品处理

样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存

有代表性的样品应当按照官方公认的方法进行采样及处理。

谷物和饲料

－－－－5g粉碎的样品与25ml 70%的甲醇水溶液（70/30（V/V））

－－－－在磁力搅拌器上搅动10分钟

－－－－用滤纸过滤或是用离心机离心进行提取

－－－－取50?l滤液或是悬浮液加入300?l样品稀释缓冲液（PBS缓冲液）[稀释倍数1：7（1+6）] 

－－－－取50?l提取液进行分析

根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加

例如：25g样品加入125ml 70%的甲醇溶液或是50g样品加入250ml 70%的甲醇水溶液。

注意：如果T-2毒素的浓度值大于56ppb,则需要对样品进一步稀释。例如：取50?l提取液与450?l的磷酸盐缓冲液（其中含有10%的甲醇溶液）混合。[稀释倍数：1：10（1+9）]

10. 酶标免疫分析程序

10.1测定之前注意事项

1.使用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。

2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3.在使用中不要让微孔干燥。

4.在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。

10.2包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻。

10.3测定程序  （在20-25℃条件下操作）

1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架。

2. 加入50?l的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50?l酶标记物（红色帽）到微孔底部。（注意移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染。）

4. 加入50?l抗体溶液（黑色帽）到每一个微孔底部，充分混合，在室温孵育1小时。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，如实验果所用孔数量多，请用多通道移液器。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

5. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250?l蒸馏水加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。（移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。洗板后要立即进行下一步操作，避免板孔干燥造成重复性差异）。

6. 加入50?l基质（绿色帽）和50?l发色试剂（蓝色帽）到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育30分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中注意避光，并用多通道移液器加液。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

7.  加入100?l反应终止液（黄色盖）到微孔中混合好，（注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm处测量吸光度值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取光度值。

11.   结果

定量分析：所获得的标准和样品吸光度值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-× 100  =   %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应T-2 毒素浓度（?g/kg）的半对数坐标系统曲线图。

试剂盒标准曲线的线性范围在0.2-0.8ppb之间。

相对应每一个样品的浓度（?g/kg）可以从标准曲线上读出。

为了得到样品的实际浓度，还应将从曲线上读出的浓度值乘以样品的稀释倍数。

谷物和饲料……………………………35或350

所以，标准曲线的线性范围应该是从3.5-56ppb或是从35-560ppb。

12．检测下限

RIDASCREEN T-2毒素标准曲线

T-2毒素试剂盒的检测下限为0.1ppb。对于谷物和饲料来说，要考虑样品的稀释倍数，所以试剂盒的检测下限为3.5ppb。

13. 交叉反应

14. 回收率

谷物及饲料…………………………………………约90%