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Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂
产品描述
Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料,常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建,DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义。疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。
常用的检测核酸的方法有:1)紫外吸光法(A260),该法操作简便,但DNA样品中核苷酸、单链DNA、RNA和蛋白质对紫外吸收信号影响很大,还容易受到核酸样品中污染物的干扰,不能区分DNA和RNA,而且灵敏度低(ΔA260=0.1相当于5ug/ml的dsDNA);2)探针杂交法,该法是传统检测微量DNA的常用方法,基本能满足目前疫苗和治疗性生物制品的检测需求,但是该法耗时较长,操作繁琐,稳定性、敏感性和特异性较差;3)Hoechst33258染料法,Hoechst33258是一种一定程度上特异于双链DNA的核酸染料,基本不受蛋白质的干扰,可以检测低至10ng/ml的DNA;在检测稳定性和灵敏度上仍达不到理想效果。
Picogreen dsDNA定量法:Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光,且所产生的荧光与DNA浓度呈正比,在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下,可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性,且几乎无序列依赖性,可以精确地测量多个来源的DNA,包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。
相比传统的方法,Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势:①灵敏度高:数量级较UV吸光读数更敏感,可节省宝贵的样品;②特异性强:在等摩尔的RNA存在的条件下,对dsDNA具有特异性;③耐受性好:耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖,可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。④易于使用——只需在样品中加入染料,等待5分钟,然后读数即可,且适用于96和384孔板;与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。⑤适用范围广:可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。
若每次分析体积为2 mL,1ml Picogreen定量试剂足够200次分析使用,若使用微孔板或96孔板检测,每次使用量200µl,则足够2000次分析。根据不同客户需求,该试剂以不同形式提供:Cat#10224ES01以每管100µl,共10管提供;Cat#10224ES02以1管1ml的形式提供。另外,翊圣提供【双链DNA(dsDNA)定量检测试剂盒(Cat#10225)】方便客户选用。
Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂运输和保存方法
室温运输。4℃避光干燥保存,有效期6个月。
Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂注意事项
1)Picogreen定量试剂含有DMSO(已知有毒试剂),请小心操作;
2)尽管目前尚未有数据表明Picogreen具有诱变性和毒性,但是该试剂能结合双链DNA,请操作时务必小心。
Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂应用实例
【注】:本方法参照2010《中国药典》进行操作的,如结果要求不是特别严格,可参照Yeasen 【双链DNA(dsDNA)定量检测试剂盒(Cat#10225)】的标曲制备方法。
1、染料工作液的配置
PicoGreen dsDNA定量试剂取出后回温至室温,该试剂是以1mL的浓缩液形式保存于无水DMSO中的。实验当天,根据实验用量用1×TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.5)按1:200 的比例稀释PicoGreen浓缩液。如,要准备足够的操作溶液测定20个样品,可在19.9mL1×TE 中加入100μL PicoGreen dsDNA 定量试剂。
Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂【注】:a、由于试剂容易吸附到玻璃表面,要在塑料容器中配制。
b、PicoGreen试剂见光易降解,所以应将配好的溶液用铝箔包住或放置暗处避光保存。
c、溶液最好在配制好数小时内使用,以保证最佳结果。
2、标准品工作液的配制
小牛胸腺嘧啶DNA干粉(Sigma货号:D4522-1MG)1mg(Tris,Nacl等浓度已成标准体系),加入1mL无菌去离子水(无Dnase),配制成1mg∕mL的标准品工作液。
【注】:标准品也可用λDNA或其他已知浓度的纯化DNA。
3、标准品工作液稀释
1)母液稀释:取10µl(1mg∕mL)标准品工作液加入到990ul TE溶液中,浓度稀释成10µg∕mL,取10µl(10µg∕mL)标准品工作液加入到990µl TE溶液中,浓度稀释成100ng∕mL;
2)倍比稀释:取800µl (100ng∕mL)的标准品工作液加入到200µl TE溶液中,浓度达到80ng∕mL,取500µl(80ng∕mL)的标准品工作液加入到500µl TE溶液中,浓度稀释到40ng∕mL;依次倍比稀释,配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液;
3)标准曲线的制备:倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100µl混匀,避光室温放置5min。使用FB-15型便携式荧光仪检测样品的荧光值:将混合后的溶液加入微量比色皿,确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank,测定样品和空白对照的荧光值;用标准品溶液的浓度(ng/ml)对应的荧光强度作直线回归,制备标准曲线。
4)测量剩余样品的荧光值。荧光计将给出一个直接的浓度读数,数据可以用来产生DNA 浓度的标准曲线。
4、结果分析
表1 标曲测定荧光值 图1 标准曲线图
- 询价产品:Picogreen dsDNA Quantitation Reagent 双链DNA(dsDNA)定量试剂 10224YB01
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