产品组成：

　　产品简介：

　　 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA 进行活性氧检

　　测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解

　　生成DCFH。而DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无

　　荧光的DCFH 生成有荧光的DCF。检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

　　 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup 是一种混合物，浓度为

　　50mg/mL。

　　 本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

　　 本试剂盒可以测定100～500 个样品。

　　使用说明：

　　1. 装载探针

　　 对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的

　　药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣

　　的药物刺激细胞，后装载探针。

　　 原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓

　　度为10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，

　　通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细

　　胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30

　　分钟后可以显著提高活性氧水平。

　　 收集细胞后装载探针：按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集

　　后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3～

　　5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细

　　胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激

　　细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

　　说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。

　　2. 检测

　　 对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光

　　酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细

　　胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

　　3. 参数设置

　　 使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱

　　和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

　　4. 其它说明

　　 阳性对照可以按照1∶1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL，可以加入1μL的阳性对照刺激。

　　通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效

　　果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓

　　度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

　　 另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000

　　稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60

　　分钟内适当进行调整。

　　 活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性

　　对照。

　　保存条件：

　　-20℃避光保存，有效期一年。

　　注意事项：

　　1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

　　2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情

　　况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考上图。

　　3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

　　4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。