质粒超大量提取试剂盒（mega10） PD1614-01

质粒超大量提取试剂盒（mega10）(Plasmid ezFilter Megaprep 10 Kit) 可在60分钟内纯化到10-12 mg高拷贝质粒。

质粒超大量提取试剂盒（mega10）组分：

Catalog#	PD1614-02
Preps	10
DNA Unit	10
Filter Unit	10
Replacement Cup	10
Buffer A1	2 x 530 mL
Buffer B1	2 x 530 mL
Buffer C1	3 x 450 mL
Buffer KB	530 mL
RNase A (20 mg/mL)	120 mg(4 x1.5 mL)
Elution Buffer	270 mL
User Manual	1

保存条件：

RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它组分室温保存。

注意事项：

1、质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇，相同体积的Wash Buffer (70% 乙醇)和Elution Buffer.
2、转化菌：若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
3、柱结合能力：10 mg

质粒超大量提取试剂盒（mega10）操作简明步骤：

1、取500µL新鲜的菌液接种到1,200-1,500 mL (勿超过2,000 mL)的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
2、加入100 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
3、加入100 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
4、加入120 mL Buffer C1,立即反转几次至出现絮状白色沉淀。涡漩震荡10 秒。充分混匀后，溶液将会变得颜色均一，如果此时溶液颜色不均一，均局部颜色过深，建议将溶液轻甩几次，以充分混合溶液，室温下静置10分钟。
5、将双层Filter unit与500 mL或1000 mL的灭菌瓶(Corning#430518 or 430282 or equivalent) 连接，旋紧，再将此装置与真空负压装置连接。
6、先将步骤“5”中底部较澄清的裂解产物用50 mL移液管转移至双层Filter unit中，静置5分钟后打开真空装置，使负压由低到高，5分钟后增至最大（0.04 Mpa）。
7、当大部分裂解液已被过滤时，关掉真空负压装置，等候1分种，拆卸装置，移去双层Filter unit。
8、再将DNA unit杯与一个新的灭菌的500 mL或1000 mL的灭菌螺口标准瓶连接，旋紧。并将过滤嘴与真空负压装置连接。将步骤“7”中收集到的裂解液中加入120 mL 100%乙醇，立即混合均匀，立即将一半倒入DNA unit杯中，开启负压装置，进行过滤吸附操作。
9、再将剩下一半倒入DNA unit杯中，当所有裂解液已过滤完，再维持真空1分钟后，关掉负压装置。
10、在DNA Unit杯中加入50 mL Buffer KB，开启负压装置至最大（0.04Mpa）并维持1分钟，使Buffer KB完全通过DNA Unit杯。
11、在DNA Unit杯中加入50 mL 70%乙醇，开启负压装置至最大（0.04Mpa）并维持1分钟，使乙醇完全通过DNA Unit杯。重复此操作步骤一次。
12、在DNA Unit杯中加入80 mL100%乙醇，开启最大负压维持1分钟，关掉负压装置，倒掉瓶子中的废液，将DNA Unit杯重新连接至标准瓶上，开启负压装置至最大负压，真空抽20分钟，以充分去除残留的乙醇。
13、关掉负压装置，静置一分钟，移去标准瓶，将DNA Unit 连接至一个新的50 mL的离心管中，并旋紧。
14、加入12 mL 灭菌 ddH2O或者Elution Buffer到DNA Unit杯的膜上，室温放置2分钟，打开负压装置至最大（0.04 Mpa）洗脱DNA。此时会收集到5~6 mＬ洗脱液，这是1^st洗脱液。
15、关掉负压装置，将DNA Unit连接至一个新的50mL的离心管中，加入12 mL 灭菌 ddH₂O或者Elution Buffer到DNA Unit杯的膜上，室温静置2分钟，开启负压装置至最大（0.04 Mpa）洗脱DNA。此时会收集到约8-10 mL洗脱液，这是2^nd洗脱液。

质粒超大量提取试剂盒（mega10）操作流程：