无内毒素快速质粒小量提取试剂盒 PD1220-02

无内毒素快速质粒小量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFlow mini kit）处理3-5mL的菌液，可获得8-30ug的质粒DNA。

无内毒素快速质粒小量提取试剂盒组分：

Catalog Number	PD1220-02
Preps	250
ezBind Columns	250
Buffer A1	70 mL
Buffer B1	70 mL
Buffer N3	20 mL
Buffer KB	135 mL
Buffer RET	135 mL
DNA Wash Buffer*	54 mL
Endofree Elution Buffer	30 mL
RNase A (20 mg/mL)	7 mg(350 µL)
User Manual	1

保存条件：

RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它组分室温保存。

注意事项：

1、质粒拷贝数: 纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100% ethonal 相同体积的DNA Wash Buffer和Endofree Elution Buffer.
2、转化菌: 若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
3、切勿直接取冻存的菌进行培养。

操作简明步骤：

1、接种新鲜的单个菌落到3-5 mL的LB培养基 (含适量抗生素)，37^oC震荡培养14-16小时。
2、室温下10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
3、加入250 µL Buffer A1 (确保已加入RNase A)，用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
4、加入 250 µL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
5、加入60 µL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
6、将离心管转至高速离心机，在室温下13,000 rpm离心10分钟（若上清中仍有白色沉淀，可再次离心）。
7、定量吸取离心后的上清液至新的1.5 mL管中，加入1倍体积的Buffer RET, (如500 µL裂解液加入到500 µL的上清液)及250 µL的100% ethonal，用手用力甩3次以混匀。
8、将溶液700 µL转移至带有收集管的DNA柱中，室温下13,000 rpm 离心20秒，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。再重复此步骤至全部溶液转移至DNA柱中。
9、可选: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室温下13,000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
10、向离心柱中加入500 µL DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇)，室温下，13,000 rpm 离心20秒，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“10”。
11、将离心柱放回高速离心机中，13,000 rpm室温下开盖离心2分钟，以彻底去除残留的乙醇。
12、将离心柱转至一个新的1.5 mL离心管中，向DNA柱的正中间加入50~100 µL(体积>50 µL)的EndoFree Elution Buffer，室温放置1分钟，13,000 rpm 离心1分钟，洗脱质粒DNA。将离心管中的洗脱液再次加到DNA柱的正中间，室温放置1分钟，13,000 rpm 离心1分钟，收集洗脱液到同一个离心管中。

操作流程：