背景资料：

B16；小鼠黑色素瘤细胞冻存细胞的复苏：   

1. 应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面 浸至水面以下不断摇动至融化。   

2. 在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管 内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。

B16；小鼠黑色素瘤细胞传代:   

1. 贴壁细胞:   

   对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。  

2. 悬浮细胞:   

   一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。

B16；小鼠黑色素瘤细胞冻存：

   将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。

B16；小鼠黑色素瘤细胞培养注意事项   

1. 玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;  2. 无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时 以上;   

3. 培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离 心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;   

4. 消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20 度保存;

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