波长的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差。光度学方法有单波长和双波长之分,有的 生化分析仪 可用三波长、甚至多波长,以及两波长比率等。有的生化分析仪可作导数光谱分析。单波长测定易受样品溶血、黄疸、脂浊等因素干扰。双波长测定可以通过副波长加以修正,减少甚至消除干扰因素,提高测定准确性。采用同光束双波长,亦有利于排除光源强度变化对结果的影响。
1、测定波长选择有三个主要条件:
(1)待测物质在该波长下的光吸收最大。
(2)其吸收峰宜较宽而钝,而不是处于尖峰或陡肩,一般不选光谱中的末端吸收峰,换句话说,该吸收峰处的吸光度随波长变化较小。
(3)常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度,即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线(光吸收曲线)。
采用透射免疫比浊法,免疫复合物大小约35~100mn之间,于波长290~410nm下有最大吸收峰,常取340nm;如用胶乳增强免疫浊度法,理想的检测波长可增至可见光区。
2.双波长测定当待测物质与干扰组分的吸收光谱互相重叠、出现非特异光吸收,或因反应液混浊出现光散射时,可以采用双波长(或多波长)测定。双波长测定的原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征,选择两个波长和,使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等,而使待测物质在两波长处的吸光系数有显著差别。
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