抗体标记与检测指南

对于初次接触抗体标记的新手而言，面对文献中发表的诸多标记方法，难免产生困惑。到底这些标记方法的关键点是什么？在具体情况下该采用何种标记方法？根据传统的标记方法，我们有必要对化学修饰的原理有一个基本的了解，因为抗体和/或标记物在进行标记（结合）反应前需要化学活化。

本指南是一个用户友好的工具，可让您学习了解常见抗体标记方法的基本知识。同时还介绍了 Lightning-Link抗体标记技术，该技术极大简化了抗体标记步骤，利用该技术标记抗体不需要您具备太多化学方面的知识，并且标记的手头操作时间仅需短短的30秒！

抗体 与标记物

抗体广泛应用于多种免疫分析中，用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗（primary antibody），赋予检测的特异性。同时，在检测中还需加入标记物（详见后文“间接标记法 Vs.直接标记法”），标记物的加入赋予可检测性。表1中列出了一些常用的免疫分析技术，及可能使用到的标记物。

表1、免疫试验的类型及其相关检测标记物

直接检测法 Vs.间接检测法

检测技术可分为两大类：直接法和间接法。对于直接检测法，标记物通过共价键连接到一抗上。而对于间接检测法，标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。

在间接法中，检测由两个部分组成：第一步，用未标记的一抗进行孵育（通常1小时），(若存在抗原)部分抗体与抗原结合，未结合的抗体则通过洗涤去掉，然后加入标记二抗。再次孵育（通常1小时），洗涤去掉未结合的二抗。然后对结合在抗体上的标记物进行量化。若有抗原存在时，标记物通常导致有色物质的生成或某一个波长的发射光量增加。当无抗原存在时，则无一抗的结合，也无二抗试剂的结合，因此无信号产生。

在直接法中，标记物直接与一抗共价结合，因此仅需一轮孵育及洗涤步骤，而间接法则需要两轮孵育及洗涤步骤。直接法简化了试验的流程，但检测的灵活性降低。下表2列举出了直接法/间接法的主要利弊。

表2.直接法与间接法的利弊比较

尽管直接标记法具有诸多潜在的优点，但为何如今众多的免疫分析仍采用间接法原理呢?

无疑，最主要的原因就是直接标记一抗相对较复杂，确实从历来经验看，抗体标记都是由那些具有化学修饰技术的专业人员来完成的。在间接法中二抗试剂所起的信号放大效应究竟如何呢？是否直接标记法所产生的信号就很弱？其实在很多情况下，间接法的放大效应是让人产生错觉的。在与二抗试剂的孵育过程及洗涤过程中，一些一抗会与抗原发生解离，因此真正被放大的只是逐渐减少的一抗的量。其实在很多情况下，直接法也可获得与间接法相同甚至更好的结果。

抗体标记方法

抗体和所有蛋白一样，是由氨基酸残基组成的。蛋白的氨基基团（包括赖氨酸侧链和氨基端）通常被用于共价链接标记物。尽管在文献中报道了多种多样的标记方法，但实际上只有4种最常用的标记方法，且不同之处仅在于标记物被转换为反应性衍生物的方式。无论何种方法，几乎毫无例外的都是将标记物共价连接到抗体分子的赖氨酸残基上。

以下是4种最主要的抗体标记法

1.琥珀酰酯 (NHS)

当使用荧光染料标记时，通常可购买内配有NHS琥珀酰酯(也称为琥珀酰亚胺酯)的活化标记物。在适当条件下，活化的染料可与抗体分子反应（抗体分子通常含有多了赖氨酸基团）而形成结合物。过量的活性染料可通过多种方法去掉（通常采用过柱层析），然后标记抗体可应用于免疫分析。

当标记物为蛋白分子（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP或藻红蛋白PE）时，由于抗体和标记分子具有多个胺，因此抗体标记流程略为复杂。在这种情况下，通常需要对其中一个分子（抗体）的一些赖氨酸进行修饰，以此创造一个新的反应基团（X），而标记物上的赖氨酸作为另一个反应基团（Y）。当抗体与标记物混合时，利用双功能试剂引入Y基团，随之与X基团发生反应，从而形成异二聚体结合物（即标记抗体）。关于双功能试剂标记抗体或其他生物分子的应用，您可以在数百篇文献报道中找到相关例子。

3.碳二亚胺（Carbodiimides）

这类试剂（EDC为常见的例子）在胺基和含羧基的分子间形成共价连接。Carbodiimides活化羧基，活化的中间体随后被胺基（由抗体分子的赖氨酸提供）吸附。Carbodiimides通常用于连接抗体和羧化的颗粒（如乳胶颗粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板或芯片表面。Carbodiimides很少用于将染料或蛋白标记物偶联到抗体上。

4.高碘酸钠（Sodium periodate）

这种化学物质对于绝大多数的标记物都是不适用的，但对于HRP标记却十分重要。高碘（Periodate）活化辣根过氧化物酶分子的糖链，从而形成醛基，后者可与抗体分子上的赖氨酸反应。由于HRP分子本身含有非常少的赖氨酸，因而相对容易获得抗体-HRP结合物，且无明显的HRP多聚化发生。

拜力生物编辑整理：www.lookbio.com