PCR扩增制备带标记探针-仪表展览网
筛选
  • 地区
    全部
  • 会员级别
    全部
筛选
  • 截止时间
    全部
PCR扩增制备带标记探针
2013/2/20 9:12:51
浏览:1568
 

PCR扩增制备带标记探针

实验步骤

 

1. 生物素标记

应用bio-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

   1) 配制反应体系

dNTP的组成  dATP、dCTP、dGTP各20mmol,dTTP 15mmol,bio-11-dUTP 5mmol混匀,其他试剂如常规PCR。

   2) 25循环后,冻存,取出化冻,趁下层水相尚在冰冻状态,吸尽石蜡油

   3) 水相中20mg/ml糖原1ul,pH5.2 2.5MnaAC10ul,220ul无水乙醇。混匀后-20℃过夜

   4) 离心取沉淀,冷冻干燥后100ul水或TE复溶。

2. 地高辛标记

应用dig-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

   1) 配制反应体系

dNTP的组成  dATP、dCTP、dGTP各200umol,dTTP 130umol,bio-11-dUTP 70umol混匀,其他试剂如常规PCR。

   2) 35循环扩增产物

30 扩增产物纯化与DIG随机标记探针方法相同(仅沉淀时,50ulPCR反应液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇)。

 

注意事项

 

1. 标记时标记基团在dNTP中占的比例不能太高,因标记基团与dTTP相比具位阻效应,比例太高PCR扩增及以后的杂交都要受到影响。

2. 靶DNA用量不能太高,生物素标记中控制在0.2fmol左右;地高辛标记中可低至0.1ng

相关资讯推荐