SPE固相萃取技术（固相萃取仪器装置）(五)

1.样品前处理的重要性

无论是对样品的化学分析还是在生物工程中，样品的分离、纯化都是必不可少的前处理步骤。样品前处理的好坏将直接影响最后的结果。

      根据LC-GC Int.杂志对世界1000多个实验室进行的统计，样品前处理所花费的时间占整个分析过程的 61%现代的自动化分析仪器使分析工作趋向简单、快速。然而，许多拥有现代化分析仪器的实验室却依然使用着古老、繁琐的样品前处理方法。样品前处理已经成为现代分析中的瓶颈，严重阻碍了分析工作的进行。因此，要提高效率，就必须解决样品前处理的问题。

      根据同一份统计报告可以看到在整个色谱分析的过程中，样品前处理产生的误差最大, 高达 30%，如果再加上操作误差，人为的因素占了误差来源的近50% 换句话来说，如果我们能解决人为因素造成的误差，分析误差产生的几率就降低了一半。

   不同的检测手段对样品前处理的要求也不相同。其主要目的大都在于：

         1.将目标化合物从基质中分离出来；

          2.尽可能地除去对目标化合物的分析有干扰的组分；

         3.尽可能地除去对分析仪器造成伤害的物质；

         4.对目标化合物进行浓缩以达到分析仪器的检测下限；

         5.调整样品的pH值、离子强度以满足分析仪器检测要求。

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2.JTONE固相萃取基本原理

2.1吸附目标化合物模式

     在吸附目标化合物模式中，SPE柱对目标化合物的吸附力大于样品基液。如下图所示，当样品通过SPE柱时，目标化合物被吸附在固体填料表面，其它大部分的样品组份则随基质通过柱子。目标化合物可用适当溶剂洗脱下来。为了方便起见，我们将这种萃取模式称为“吸附目标化合物模式”或“目标化合物吸附模式”在这种萃取模式中，SPE柱在吸附目标化合物的同时，可能也会吸附一些对分析有影响的干扰物。因此，在对目标化合物进行洗脱之前，要对SPE柱进行洗涤，最大限度地清除这些干扰物。

如上图所示，吸附目标化合物模式可以分为以下几个步骤：

SPE柱预处理（弃去过柱液体）

样品过SPE柱（弃去过柱液体）

SPE柱洗涤及干燥（弃去过柱液体）

目标化合物洗脱（收集过柱液体）

2.2吸附杂质模式

在固相萃取过程中，当样品通过SPE柱时，SPE柱吸附样品中的杂质，而目标化合物随样品基质通过SPE柱。我们称之为“吸附杂质模式”或“杂质吸附模式”，这种模式多用于样品净化。在这种萃取模式中，样品过柱后的组分和柱洗涤的组分要一并收集。与目标化合物吸附模式不同，杂质吸附模式中的柱洗涤是要将残留在SPE柱上的目标化合物洗脱下来，而将杂质保留在SPE柱上。

   在吸附杂质模式中可以分为以下几个步骤：

SPE柱预处理（弃去过柱液体）

样品过SPE柱（收集过柱液体）

SPE柱洗涤（收集过柱液体至上述收集液体的试管中）

3.JTONE固相萃取中的主要作用力

3.1固相萃取中的非极性作用力

固相萃取中的非极性作用力产生于固相萃取材料功能团上的碳氢键与样品中化合物的碳氢键之间。这种作用力既为人们所熟悉的范德华引力或散射力。由于有机分子或多或少都存在这种非极性结构，非极性作用力常常被用于从样品基质中吸附分离具有非极性结构的化合物。

      使用最多的非极性SPE柱是具由十八个碳组成的碳链官能团，俗称为C18柱。由于C18材料在液相色谱中广泛使用，所以人们对其性能也较为了解，在SPE中也大量使用。一般说来，非极性SPE柱通用性比较好。所以比较适合用于同时萃取多种不同化学性质的化合物。但其选择性则比极性或离子交换作用力差。

      通常，非极性SPE柱较适用于从极性基质中萃取分离非极性及中等极性的目标化合物。

      对于通过非极性作用力吸附在非极性SPE柱上的目标化合物，可以用具有非极性性质的溶剂洗脱，如氯仿、环己烷等。即便是极性较强的甲醇对于许多化合物来说也具有足够的非极性作用力将其洗脱。

3.2固相萃取中的极性作用力

固相萃取中的极性作用力在许多固相萃取材料官能团及样品中的化合物都可以发生。极性作用力包括：氢键、偶极力/偶极力、诱导偶极力、π-π等。如： 羟基、氨基、巯基, 羰基、芳香环及含氧、氮、硫、磷等杂原子的基团。其中氢键是最常见的极性作用力。

      非极性的基质环境有利于吸附剂和目标化合物之间的极性作用力；极性环境有利于破坏吸附剂和目标化合物之间的极性作用力；环境离子强度大也不利于吸附剂和分析物之间的极性作用力。

      值得指出的是所有以键合硅胶为材料的SPE柱，由于键合硅胶本身具有一定数量的没有键合的 –OH基团（没有封尾），所以都具有极性。这种极性功能在非极性溶剂中最明显。

在极性萃取中常用的洗脱溶剂有：甲醇、水、THF、异丙醇、乙酸、乙腈、丙酮、胺类、高离子强度缓冲液或上述溶液的混合液。

3.3固相萃取中的离子作用力

离子作用力发生在带相反电荷的样品化合物与SPE填料官能团之间。对有机化合物而言，能够产生离子交换作用的化合物官能团有两类：

          1.可生成阳离子的官能团（带正电荷）

          2.可生成阴离子的官能团（带负电荷）

      常见阳离子的官能团包括：伯，仲，叔，丁胺类。

      常见阴离子的官能团包括：羰基，磺酸基，磷酸基等。

      要正确使用离子交换柱进行固相萃取，必须注意控制萃取环境。为了有效地利用离子交换机理将目标化合物吸附在固相柱上，必须满足以下两个条件：

          1. 环境的pH必需使分析物和吸附剂带相反电荷

          2. 环境不能含有高浓度带有和分析物相同电荷的竞争化合物

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      在实际操作中为了确保目标化合物及SPE填料官能团能够99%以上带电或呈中性（不带电），可以根据目标化合物及SPE填料官能团的pKa来决定。

      要用阴离子交换剂将可生成阴离子的弱酸性化合物 99%吸附，目标化合物所处环境体系的pH值要高于该目标化合物的pKa两个pH单位。要使99%目标化合物脱附，则环境体系的pH值必须低于该化合物的pKa两个pH单位。

      反之，要用阳离子交换剂将可生成阳离子的弱碱性化合物99%吸附，环境体系的pH值必须低于该化合物的pKa两个pH单位。要使99%该化合物脱附, 体系环境的pH值必须高于该化合物的pKa两个pH单位。

      在应用离子交换作用力进行SPE萃取时还必须考虑离子强度和选择性。一般说来，低离子强度有利于分析物的吸附，高离子强度有利于分析物的脱附。离子交换剂选择性的强弱取决于其功能团的性质。如：对柠檬酸阴离子而言，季胺(强阴离子交换剂)就优于醋酸根阴离子的250倍。因此，用醋酸根阴离子溶液处理的季胺吸附剂对分析物的吸附力远比用柠檬酸阴离子溶液处理的季胺吸附剂强。反之,柠檬酸阴离子溶液是一个好的洗脱剂。

      在应用离子交换SPE萃取时，了解目标化合物的pKa对于调节样品的pH值十分重要。但是由于种种原因，常常不知道其pKa。这就给实验带来了一定的盲目性。在这种情况下，我们可以参考官能团的pKa值来调节样品的pH。由于同一官能团在不同分子中所处的位置不同，化合物的立体结构也不同，官能团的pKa值与含有该官能团的化合物的pKa值是有所差异的。

    在阴离子交换萃取中，目标化合物可以通过以下五种方式进行洗脱：

1.pH高于填料官能团pKa两个pH单位的缓冲溶液。在该pH条件下，阴离子交换剂的官能团呈中性。

2.pH低于带有阴离子官能团的目标化合物两个pH单位的缓冲液。在该pH条件下，目标化合物的阴离子官能团呈中性。

3.高离子强度缓冲溶液（>0.1 M）。缓冲溶液中的高强度阴离子高阴离子浓度会导致阴离子与目标化合物产生竞争，将目标化合物释放出来。

4.洗脱液为含有高选择性的阴离子。由于这些阴离子对吸附剂阴离子交换官能团具有很高的吸引力，可以将目标化合物从阴离子交换柱上交换出来，从而达到洗脱分离的目的。

5.上述几种方法的结合使用也可以达到洗脱阴离子目标化合物的目的。

      在阳离子交换萃取中，洗脱溶剂的选择原则与阴离子交换柱相反：

1.洗脱溶剂的pH低于吸附剂的阳离子交换官能团pKa两个pH单位。这样就可以使该官能团呈中性，将目标化合物释放出来。

2.洗脱溶剂的pH高于目标化合物pKa两个pH单位。在此条件下，目标化合物呈中性状态，与吸附剂阳离子官能团分离，被洗脱溶剂洗脱出来。常常可以在甲醇中加入氢氧化钠、氢氧化钾或氨水来实现pH的调节及目标化合物的洗脱。如果需要降低洗脱馏分中水的含量，则可以在有机溶剂中加入1%~2%的有机胺来实现这种洗脱。

3.洗脱溶剂为高阳离子强度 (>0.1 mol/L)的缓冲溶液。高阳离子浓度会导致阴阳离子与目标化合物产生竞争，将目标化合物释放出来。

4.洗脱液为含有高选择性的阳离子。由于这些阳离子具有对填料阳离子官能团具有很高的吸引力，可以将目标化合物从阳离子交换柱上交换出来，从而达到洗脱分离的目的。

5.上述几种方法的结合使用也可以达到洗脱阳离子目标化合物的目的。

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3.4JTONE固相萃取中的多种作用力

    在固相萃取中常见的多种作用力有两类。一类是固相萃取材料本身所具有的，如以键合硅胶为基质的固相萃取材料；另一类是人为引入的，如混合型SPE柱。有关混合型SPE柱请参阅相关资料。

      必需强调，几乎全部的键合硅胶都存在多于一种以上的作用力。因此，在考虑固相萃取方法时应该综合考虑各种作用力对萃取过程的影响。

      键合硅胶柱存在的付作用力对于目标化合物的萃取有时是不利的，应该尽量避免。但这种副作用力有时是有利的，应该充分利用。

常见键合硅胶SPE柱多种作用力

● ─ 主作用力                                          2OH ─ 二醇基 (Diol)

○ ─ 第二作用力                                       SI ─ 未键合硅醇基

◙ ─ 活性硅醇基                                       NH2 ─ 丙氨基 (Aminopropyl)

C18 ─十八烷基 (Octadecyl)                     PSA ─ 一元/二元氨基- (Ethylenediamine-N-propyl)

C8 ─ 辛烷基 (Octyl)                                DEA ─二乙基丙氨 (Diethylaminopropyl)

C2 ─ 乙烷基 (Ethyl)                                SAX ─ 三甲基丙基胺 (Trimethylaminoprooyl)

CH ─ 环己基 (Cyclohexyl)                       CBA ─ 甲羧酸基 (Carboxymethyl, H-form)

PH ─ 苯基 (Phenyl)                                PRS ─ 丙磺酸基 (Sulfonylpropyl, Na-form)

CN ─ 氰基 (CN)                                      CX ─ 苯丙磺酸基 (Propylbenzenesulfonly, H- form)

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