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气相色谱法测定氯酶素残留含量
2010/7/28 15:18:15
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本方法用于测定肉牛的肌肉组织中氯霉素的残留量。
2 原理
组织经β-葡萄糖醛酸酶消化，经乙酸乙酯提取，然后将乙酸乙酯浓缩。加4％氯化钠溶液，剩余的乙酸乙酯用氮气吹干。将盐溶液过C18萃取小柱，用20％甲醇洗涤，用甲醇洗脱。将洗脱液蒸发至干并固化，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定氯霉素。异氯霉素做内标物定量。
3可靠的检测限
本方法在牛肌肉组织的检测限为1.0ng/g。
4仪器
4.1气相色谱仪，配电子捕获检测器（63Ni）。
4.2电子天平：感量0.00001g。
4.3匀浆机。
4.4离心机。
4.5旋转蒸发仪。
4.6振荡器。
4.7电热恒温水浴锅。
4.8固相萃取柱：C18柱。
5药品与试剂
5.1氯霉素标准品：纯度≥99％。
5.2异氯霉素标准品：内标物。
5.3β-葡萄糖醛酸酶－IX：生化试剂。
5.4甲醇：分析纯。
5.5乙酸乙酯：分析纯。
5.6正已烷：分析纯。
5.7三氯甲烷：分析纯。
5.8乙腈：色谱纯。
5.9环已烷：分析纯。
5.10氯化钠：分析纯。
6溶液
6.1氯霉素标准液：准确称取氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成浓度为500μg/mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存。临用前，取此储备液，用甲醇稀释成浓度为100μg/mL的标准工作液。
6.2异氯霉素标准液：准确称取异氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成浓度为500μg/mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存。临用前，取此储备液，用甲醇稀释成浓度为100μg/mL的内标液。
6.30.1mol/L?KH2PO4和Na2HPO4的缓冲液（pH6.8±0.1)：用相应的干试剂调节pH为6.8。
6.4β-葡萄糖醛酸酶－IX：用缓冲液稀释至4000单位／mL。
6.5Sylon?HTP溶液：六甲基二硅烷（HMDS）3份，氯化三甲基硅烷1份，吡啶9份。
7 分析
7.1提取和纯化
7.1.1将组织解冻，称取肌肉组织10g（精确到0.1g），置于50mL玻璃离心管中。向每个样品中加100μL异氯霉素内标液（100μg/mL）。
7.1.2每个分析样品配制1个空白、3个添加样品。向空白组织中加内标。回收率样品中加工作液，制成0.5mL/L（50μL工作液），1.0mL/L(100μL工作液），2.0mL/L(200μL工作液）的样品。由添加样品得到的数据用于计算。
7.1.3向所有空白、添加对照和样品管中加15mL磷酸盐缓冲液（pH6.8±0.1)和200μL－β-葡萄糖醛酸酶（800单位），在室温条件下混合30s-60s。
7.1.4将所有管置于37℃保温90min。保温后，样品可以放在冰箱中过夜。
7.1.5样品放回室温平衡。向各管加乙酸乙酯15mL，旋涡混合30s提取氯霉素。
7.1.62000r/min的速度离心2min。
7.1.7用一次性滴管吸取乙酸乙酯液（上层）留用并转移到另一干净的50mL离心管中。
7.1.8重复（步骤D.7.1.5-D.7.1.7)提取样品，并合并提取液。
7.1.9在氮气流下，用温度约60℃的沙浴去除乙酸乙酯使体积约为1mL。
7.1.10向各管加4％氯化钠溶液4mL，混合5s-10s。
7.1.11继续蒸发去除乙酸乙酯至乙酸乙酯层干，剩下小量的油性残留物。
7.1.12向4％氯化钠溶液层加正已烷4mL，混合10s。2000r/min的速度离心1min，弃掉上层。
7.1.13重复步骤D.7.1.12。
注意：以下步骤D.7.1.14至步骤D.7.1.17必须立即连续做完。切莫让吸附剂变干。
7.1.14给每个样品、空白和添加对照准备一根C18柱，顺序用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇和10mL水洗涤C18柱。弃掉洗涤液。
7.1.15用一次性巴氏吸管吸取全部水相溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。
7.1.16用1mL水混合淋洗样品管2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。
7.1.17用1mL水，然后2mL甲醇－水（2＋8）洗涤C18柱。让最后一次洗涤液完全流出C18柱。弃掉洗液。
7.1.18用乙腈将C18柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5mL，合并洗脱液到一干净的10mL培养管中。
7.1.19在氮气流下，用温度约60℃的沙浴蒸发去除乙腈至约为0.5mL。
7.1.20转移至1mL锥形瓶中。用0.5mL乙腈洗涤10mL培养管，旋涡混合5s，并将洗涤液加到1mL锥形瓶中。在60℃用氮气流吹干。
注意：从这儿开始要防潮。
7.1.2向干的残留物中加200μL??Sylon?HTP。
7.1.22盖塞并旋涡混合5s。在60℃－70℃沙浴中反应15min。
7.1.23在60℃用氮气流吹干去除多余的试剂蒸发至10μL。
注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物。
7.1.24将残留物重新溶于100μL环已烷－正已烷（6＋4）中，旋涡混合5s。
7.1.25注入适量微升体积的衍生物到气相色谱仪作定量测定。
7.2测定条件
7.2.1色谱柱：DB－1，30m×0.254mm?i.d.。
7.2.2载气：氦气，线性速度29cm/s。
7.2.3初始柱温：80℃，维持1min。
7.2.4温度程序：设定30℃／min升至260℃，维持10min或直到对位异构体和氯霉素已经流出。然后设定30℃／min升至300℃，维持5min以确保所有的样品已经流出。
7.2.5进样室温度：280℃。
7.2.6检测器温度350℃。
7.2.7预期保留时间：氯霉素10min-11min，异氯霉素9.5min-10.5min。
7.2.8预期响应值：对0.2ng氯霉素可以达到50％全刻度。
7.2.9进样量：适量。
7.3样品测定
分别注入适量标准工作溶液及适当浓度的样品溶液于气相色谱仪中，按上述色条件进行色谱分析。响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
7.4计算
用色谱数据处理机或按式（D.1)计算试样中氯霉素残留量：
W＝H·CS／HS·C………………………………（D.1)
式中：
W－试样中氯霉素残留量，单位为微克每克（μg/g)；
H－试样液中氯霉素的峰高，单位为毫米（mm)；
Hs－标准工作液中氯霉素的峰高，单位为毫米（mm)；
CS-标准工作液中氯霉素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；
C－最终试样液所代表的试样的浓度，单位为克每毫升（g/mL)。
注：计算结果需扣除空白值。