人促性腺激素释放激素ELISA试剂盒说明书-仪表展览网
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人促性腺激素释放激素ELISA试剂盒说明书
2010/8/30 17:19:42
浏览:590

  预期应用

  ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中GnRH含量。

  概述

  实验原理

  本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中GnRH水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入GnRH、生物素化的抗人GnRH抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GnRH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

  试剂盒组成

  1. 酶联板:一块(96孔)

  2. 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,其浓度为1000mIU/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成1000 mIU /mL,500 mIU/mL ,250 mIU/mL,125 mIU/mL,62.5 mIU/mL,31mIU/mL,15.6 mIU/mL,其原液直接作为最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 mIU/mL,临用前15分钟内配制。

  如配制500mIU/mL标准品:取0.5ml1000 mIU/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

  3. 样品稀释液:1×20ml/瓶。

  4. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。

  5. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。

  6. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释。

  7. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。

  8. 底物溶液:1×10ml/瓶。

  9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

  10. 终止液:1×10ml/瓶(2NH2SO4)。

  标本的采集及保存

  1.细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。

  2.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

  3.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

  注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

  操作步骤

  各试剂在使用前平衡至室温。

  1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,轻轻混匀,37℃,120分钟。

  2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。

  3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul,37℃,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。

  4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul,37℃,60分钟,洗板5次,甩干。

  5. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟。

  6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

  注:

  1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

  2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

  洗板方法

  手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层

  吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。

  自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

  特异性

  本试剂盒可同时检测重组或天然的人GnRH,且与其它相关蛋白无交叉反应。

  计算

  以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

  注意事项

  1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

  2. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

  3. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

  4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

  5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

  6.底物请避光保存。

  检测范围:

  15.6 mIU /mL -1000mIU /mL

  说明

  1.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。

  2.有效期:6个月

  3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

  4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

  5.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

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