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蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分,如水解后的产物经胨,肽等最后成为氨基酸,氨基酸是构成pro最基本的物质。
水解后的pro和水解前的pro在物理特性,化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的,其差别与水解的程度有密切关系,分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度,也就可以评价食品的营养价值。
氨基酸不是单纯的一种物质,用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵,不能普遍使用),对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中,所以需要测定总的氨基酸量,它们不能以氨基酸百分率来表示,只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分率表示,当然,如果食品中只含有一种氨基酸,如味精中的谷氨酸,就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。
食品在评价蛋白质的营养价值时,除了测定pro的含量,氨基酸氮含量,还需要对各种氨基酸进行分离,鉴定,尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。
一.单指示剂甲醛滴定法:
1原理:氨基酸具有酸,碱两重性质,因为氨基酸含有-COOH基,而-COOH基显示酸性,又含有-NH2,-NH2则显示碱性,由于-COOH基和-NH2的相互作用,使氨基酸成为中性的内盐,当加入甲醛溶液时,-NH2与甲醛结合,其碱性消失,破坏内盐的存在,就可用碱来滴定-COOH基,以间接方法测定氨基酸的量,反应式以三种形式存在。
用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2。
2试剂:
(1)40%中性甲醛溶液:以百里酚酞作指示剂,将甲醛用1N NaOH溶液中和(淡兰色)。(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N NaOH标准溶液。
3操作步骤:
称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中(如为固体样加水50ml)→加两滴指示剂→用0.1NNaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡兰色,记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。
计算:氨基酸态氮=(N×V×0.014×100)/W×100
二.双指示剂甲醛滴定法
1原理:
与单色法相同,只是在此法中使用了两种指示剂,从分析结果看,双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂,但准确,不作介绍)相近,单色滴定法稍偏低,主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点,PH值为7.0,从理论计算看,双色滴定法比单色滴定法准确。
2试剂:同单指示剂一样,多一个0.1%中性红(50%乙醇溶液)
3操作步骤:
取相同两份样品→分别于100ml三角瓶→一份加中性红2滴→用0.1N NaOH滴定终点(由红变琥珀色),记录用量,另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1N NaOH滴至淡兰色。
计算:
氨基酸态氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100
V1——用中性红为指示剂时,碱液所消耗的体积
V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量
0.014——氮的毫克当量浓度
氨基酸总量的检测
注意事项:
(1)单色指示剂甲醛滴定法,用碱完全中和—COOH基时的pH为8.5—9.5
(2)测定样品的颜色较深,应加活性炭脱色之后再滴定
三.茚三酮比色法:
1原理:氨基酸在一定pH范围内,能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。
2试剂:
(1)磷酸缓冲液(pH.8.04)制备方法如下:
称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml
称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml
取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
(2)2%茚三酮溶液:
称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)搅拌过滤(作防腐剂)→于冷暗处过夜→定容50ml
① 氨基酸标液
称干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml,即得200Ug/ml标液
3操作方法:
(1)绘制标准曲线:
取7个25ml容量瓶,吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶,加水补充至容积为4ml,然后加茚三酮和缓冲液各1ml,于水浴加热15分钟,冷却后定容25ml,静置15分钟,在570nm下测消光值,绘制标准曲线。
(2)样品测定:
取样品5.00~10.0g(液体样5-10ml)→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟,冷却定容,静置15分钟于570nm下测定消光值,按下式计算氨基酸含量。
氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100
C——从标准曲线上查得得氨基酸的量(Ug)
W——测定得样品溶液相当于样品的量(g)
注意事项:
茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色,使用前要进行纯化,方法如下:、
取10g茚三酮容于40ml热水中,加一克活性炭,摇匀静置30分钟,过滤,将滤液放入冰箱中过滤,即出现兰色结晶,过滤,用2ml冷水洗涤结晶,置干燥皿中干燥,装瓶备用