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氨基酸分析方法及仪器比较
2012/8/10 11:01:24
浏览:1401

一、氨基酸分析方法分类
氨基酸分析按其分离和检测方法的不同可分为三大类型。第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法(IEC)。此类方法由Stein和Moore两人1958年发明,并于1972年获诺贝尔奖,是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法(HPLC)。第三类是阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法IC,严格说来,阴离子交换和阳离子交换都叫“IEC”,在此将阴离子交换分离、安培检测的方法归类为IC,是因为这类仪器实际上就是离子色谱仪,只不过配置侧重点为氨基酸分析。本文中对三类方法多用简称。

氨基酸分析方法的分类和特性比较表

方法
IEC
HPLC
IC
原理
阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生光度法测定
高效液相反相色谱分离、柱前衍生、光度法测定
阴离子交换直接测定
衍生试剂
茚三酮
PITC
OPA
FMOC
AQC
DABS-Cl
基体干扰
多余试剂
不干扰
需除去
不干扰
需除去
不干扰
需除去
可见光
UV
荧光
荧光
荧光
UV
脉冲安培
检测限
5-10 pmol
30pmol
1pmol
1pmol
1pmol
30pmol
0.5pmol
优点
方法成熟可靠。稳定性、重现性、线性均优于HPLC法,柱子寿命长,几乎可分析已知的所有氨基酸(最多可同时分离50余种)
对一些氨基酸有很高的灵敏度,分析时间较短,仪器可一机多用(在氨基酸分析和其它分析转换时,需要更换一些部件,如柱子、缓冲液等,通常更换之后还需要较长时间重新平衡系统)
缺点
对大多数氨基酸的灵敏度不如HPLC法和IC法。仪器专用化,售价较高
衍生反应和产物稳定性常受基体和过量试剂干扰,方法的稳定性、重现性、线性和可靠性不如茚三酮法,能分离分析的氨基酸种类较少。且柱子寿命短,衍生试剂一般较贵,方法对操作技术要求高。(其中个别方法的稳定性、重现性、线性等指标已接近IEC法,但衍生试剂是独家专利,售价极高,总体成本甚至超过IEC法的仪器)
易受细菌干扰,测量结果与茚三酮法有较大差异,稳定性、重现性与HPLC法接近

说明: 1、PITC异硫氰酸苯酯;OPA邻苯二甲醛;FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯;AQC 6-氨基-喹啉基-N-羟基琥贝酰亚胺-氨基甲酸酯;DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯。
2、IEC法也可使用柱后OPA衍生(荧光检测),可以降低检测限到1pmol,但无法检测二级氨基酸。
二、用户如何选择适合自己的方法和仪器
氨基酸分析的方法和仪器多种多样,用户应该根据自己的实际应用情况和发展趋势来选择方法和仪器。选择时可参考以下几个方面:
是否需要对分析结果负责(如对外出具报告等)
IEC仪器使用茚三酮柱后衍生法,符合国家标准和国际仲裁标准,而IC法和HPLC法虽然总体性能也比较稳定可靠,但其测量结果与茚三酮法有较大差异,且结果难以长期重复,这对于仲裁不利。目前,IC法和HPLC法分析氨基酸一般仅用于不太深入的研究,而且主要是利用其灵敏度较高的特性。也有部分企业用来做内部质量控制(国家没有制定相关标准),但如果要考虑对外做样并出具结果报告,IEC仪器是唯一选择。由于国内的氨基酸分析呈现急剧上升的势头,而很多单位经济能力有限,因此也确有不少单位购买专用氨基酸分析仪作为创收手段。
一次进样需要出峰的数量是多还是少 氨基酸种类繁多、性质接近,因此氨基酸分析是色谱界公认的难题,尽管现在有多种多样的方法,但没有任何方法能够保证所有氨基酸峰能够一次进样完全的分离。仅仅从分离程度来说,好的HPLC方法最多可以一次分离检测20种左右的氨基酸峰,IC法最多可一次分离检测约30种氨基酸峰(理论上说来,IC法可达到与IEC法相当的出峰数量,但金电极的基线漂移较大,保留时间太长的峰就难以定量分析),IEC法最多一次可分离检测50种左右的氨基酸峰。从这个角度来说,如果您需要分析游离氨基酸样品,就应当选择IEC仪器。
3、 氨基酸分析频率高还是低
氨基酸样品分析频率如果达到每个星期至少1次,就可以算“频率较高”,少于每周1次就可以说是“较低”。频率较高时,应当仪器专用化(即便是用HPLC和IC法,也应专用于氨基酸分析),因为反复更换柱子和缓冲体系不仅麻烦、平衡时间长,难以保证分析结果的可靠性和重复性,而且容易损坏仪器。
氨基酸样品总量是多还是少总体的成本应考虑到做样成本,而不能只看仪器本身。HPLC做氨基酸分析时,每根柱子只能进样100-500针,而IEC仪器的柱子都超过1000针(sykam柱子使用国产试剂时大于4000针,使用进口试剂时大于6000针)。
如果都使用国产试剂,HPLC仪器单针成本平均160元人民币,IEC仪器单针成本平均不到20元人民币,IC仪器单针成本平均60元人民币(IC法无需衍生剂,但检测电极是消耗品)。此处计算了标样、缓冲溶液、衍生剂、柱子等消耗品价格,而仪器的维护保养费用相同(未计算)。下表是专用氨基酸分析仪IEC、HPLC和IC(都配置自动进样,HPLC加配氨基酸分析包)的总成本分析。
三种分析方法的总费用比较

总费用
IEC
HPLC(平均值)
IC
初次花费
65万-75万
30万-40万
55万-65万
600个样品(1500针)
68万-78万
54万-64万
64万-74万
1000个样品(2500针)
70万-80万
70万-80万
70万-80万
2000个样品(5000针)
75万-85万
110万-120万
85万-95万

也就是说,当分析样品量超过 1000 个(进样针数大于 2500),IEC 专用氨基酸分析仪就开始成为 费用最低的仪器了。通常仪器的使用寿命超过 8 年(平均 10 年左右),只要每年的样品量大于 100 个, IEC 仪器就没有价格上的劣势。
 三、哪些仪器是“氨基酸分析仪”
我们已经比较了 HPLC、IC 和 IEC 这三大类氨基酸分析方法,总的说来,它们适合不同情况下的应用, 虽然 IEC 茚三酮柱后衍生法适应范围更广泛,但仪器售价也明显要高。目前中国市场上号称是专用氨基酸 分析仪的有很多,对于用户而言,也未必需要去分辩谁是真正的专用氨基酸分析仪,而且国家仪器名录甚 至国际上都没有明确提出专用氨基酸分析仪的定义,但在中国市场,无论是使用者还是仪器厂家,一般都 是把阳离子交换分离、茚三酮柱后衍生法仪器叫作“氨基酸分析仪”。这类仪器技术门槛较高,国内目前 还没有厂家生产此类仪器,代表厂商有德国 sykam、日本 hitachi 等。而 IC 法仪器的代表是 Dionex 公司的 AAA-direct。
四、IEC 仪器之间的比较
IEC仪器也有几个厂家生产,用户该如何选择? 第一,当然是满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求,而其中的分离度又是更为重要的指 标,因为,色谱理论一般以分离度达到 1.2 作为两峰基本分离的判定前提,只有峰分开了,才有意义去讨 论定性和定量的重复性。 第二,应考虑仪器的可靠性。如果仪器今天堵了、明天漏了,用户不仅要付出大量人力财力,分析结 果的可信度也将大打折扣。 第三,应考虑仪器的运行成本。例如是否可以使用国产试剂、柱子寿命(以多少次进样计算、而不以 多少年计算)等。 第四,应考虑仪器设计是否有利于氨基酸分析,例如是否有惰性气体保护(茚三酮极易被氧化)、是 否提供在线脱气、是否提供溶液和样品的制冷控制等。 第五,应考虑售后服务。分析过程中遇到困难是在所难免,厂家必须能够快速响应、尽快解决问题。 另外,常用备件的价格也是一个重要因素,因为用户在购买前一般难以注意到售后的问题,而很多厂家也 没有公示自己的常用备件价格,这就为将来的使用埋下了隐患,事实上,也的确有很多仪器(尤其是进口 仪器)在出现一些看似微小的故障之后,就因为维修费用太高而被“束之高阁”。
声明:
1、 本文部分资料引用自《仪器信息网》中公开的文章,在此对作者表示感谢!
2、 本文旨在为读者提供一个了解氨基酸分析方法和仪器的参考,若对文中观点存有异议, 欢迎指正。
 
《氨基酸分析方法及仪器比较》
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