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SN/T 2127-2008进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法
2012/9/16 14:03:00
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进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物
残留检测方法 微生物抑制法
１ 范围
本标准规定了动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。
本标准适用于牛奶、肉类、鱼和虾中的苄青霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素和头孢噻呋等药物残留筛选检测，阳性结果应用其他方法进行确证。
２ 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/B 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2208，ISO 3696：1987，MOD）
３ 试样制备和保存
３.１ 试样制备
３.１.１ 牛奶：取不少于500 ｍＬ 试样，装入清洁容器内，并标明标记。
３.１.２ 肉类、鱼和虾：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于500ｇ试样。装入清洁容器内，并标明标记。
３.１.３ 制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
３.２ 试样保存
３.２.１ 牛奶：０℃～４ ℃保存。
３.２.２ 肉类、鱼和虾：试样于－１８℃以下保存，新鲜或冷冻组织样品可在２℃～６℃保存７２ｈ。
４ 测定方法
４.１ 方法提要
试样经缓冲液提取、温育和离心后，取上清液进行测定。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试
样中是否含有抗生素。
４.２ 设备和材料
４.２.１ 恒温箱：６３ ℃±１℃。
４.２.２ 离心机。
４.２.３ 高速组织捣碎机。
４.２.４ 恒温水浴锅：８０℃。
４.２.５ 涡旋振荡器。
４.２.６ 显微镜：１０×～１００×。
４.２.７ 游标卡尺：测量范围０ｍｍ～２００ｍｍ，精度０．０２ｍｍ 或抑制圈测量仪。
４.２.８ 灭菌平皿：直径９０ｍｍ，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。
４.２.９ 圆形滤纸片：直径１０ｍｍ，厚１.１ｍｍ。日本Ｔoyo Roshi Kaisha,Ltd.产品或同类产品。
４.２.１0 克氏瓶。
４.２.１1 可调移液器：１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ。
４.３ 菌种和培养基
４.３.１ 菌种
嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilusATCC10149。
４.３.２ 培养基
４.３.２.１ 细菌保存培养基：见附录Ａ 第Ａ．１章。
４.３.２.２ 菌种芽孢培养基：见附录Ａ 第Ａ．２章。
４.３.２.３ 检定培养基：见附录Ａ 第Ａ．３章。
４.４ 试剂
除非另有说明，本标准所用化学试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682的规定。
４.４.１ １.0 mol/L盐酸溶液
量取９０ｍＬ 浓盐酸用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ。
４.４.２ １.0 mol/L氢氧化钠
准确称取４．０ｇ氢氧化钠，溶解于１００ｍＬ 蒸馏水中。
４.４.３ 缓冲液
４.４.３.１ ｐＨ6.0 磷酸盐缓冲液：称取8.0ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ₂PＯ₄）及2.0ｇ磷酸氢二钾（Ｋ₂ＨＰＯ₄．３Ｈ₂Ｏ），用蒸馏水溶解并定容至１０００ｍＬ，１２１ ℃高压灭菌１５min。
４.４.３.２ 磷酸盐缓冲液丙酮
磷酸盐缓冲液丙酮：按体积比ｐＨ６．０磷酸盐缓冲液∶丙酮＝１∶１比例制备。
４.４.４ 抗生素标准液
４.４.４.１ 标准品：苄青霉素，纯度≥９９％。
４.４.４.２ 苄青霉素标准储备液：准确称取适量的苄青霉素标准品，用灭菌ｐＨ６．０ 磷酸盐缓冲液
（４.４.３.１）溶解并定容至１０００μｇ／ｍＬ，置２℃～８ ℃冰箱保存，贮存期７ｄ。
４.４.４.３ 苄青霉素标准工作液：吸取适量的苄青霉素标准储备液，用ｐＨ６．０磷酸盐缓冲液（４.４.３.１）稀释成０．００５μｇ／ｍＬ的标准工作液，应当日配制使用。
４.５ 测定步骤
４.５.１ 样液提取
４.５.１.１ 牛奶：取２０ｍＬ 鲜奶于５０ ｍＬ 离心管，３０００ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，除去上层脂肪层，以１．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液或１．０ｍｏｌ／Ｌ 氢氧化钠调节ｐＨ 至６．５～７．０。脱脂奶可直接用于检测。
４.５.１.２ 肉类、鱼和虾：称取１０．０ｇ 均质好的试样于５０ｍＬ 离心管中，加入磷酸盐－丙酮缓冲液１０ｍＬ，用涡旋振荡器充分振荡３ｍｉｎ，于８０ ℃水浴保温３０ｍｉｎ后，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ取上清液作为样液。
４.５.２ 菌悬液的制备
嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149菌悬液：一般情况下，菌种的传代次数不应超过５代，否则在每次
使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，５５ ℃±１ ℃培养７２ｈ镜检芽孢数达８０％以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，８０ ℃水浴加热３０ ｍｉｎ，经３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃去上清液，如此重复洗涤芽孢两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行计数以确定菌种的浓度。置２ ℃～８℃冰箱保存，贮存期３０ｄ。
４.５.３ 检定用平板的制备
将试验菌悬液按一定的比例加入到融化后冷却至６０℃左右的灭菌检定培养基中充分混匀后，使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到１．０×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬ。在灭菌平皿中加入６ｍＬ 混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定用平板两个，分别放置两个滤纸片，加入约９０μＬ（以纸片吸满为准）０．００５μｇ／ｍＬ苄青霉素标准工作液，冷藏放置３０ｍｉｎ后，６３ ℃±１ ℃培养３．５ｈ能产生１４ｍｍ 以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格，达不到要求的平板应弃去。制备好的平板置２ ℃ ～８ ℃ 冰箱可保存２ｄ～３ｄ。
４.５.４ 测定
取制备好的检定用平板两个，在平板底部作好标记，将滤纸片适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过６个，在其中一个滤纸片加入约９０μＬ（以纸片吸满为准）０．００５μｇ／ｍＬ 苄青霉素标准工作液作为阳性对照，其余的滤纸片中加入约９０μＬ 样液，冷藏放置３０ｍｉｎ后，６３ ℃±１ ℃培养３．５ｈ后开始观察，如果０．００５μｇ／ｍＬ 苄青霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且大于１４ｍｍ 时终止培养，记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做两个平板上的平行试验。
４.６ 检测结果判断和报告
４.６.１ 如果样液在平板上无抑菌圈，０．００５μｇ／ｍＬ 苄青霉素标准工作液的抑菌圈直径大于１４ｍｍ，即报告“阴性”。
４.６.２ 如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在１３ｍｍ 以上，即报告“初筛阳性”。
４.６.３ 如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于１３ ｍｍ，大于１０ ｍｍ，或者两个平行结果不一致时，视为可疑，应重新测试后判定。
４.６.４ 阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。
５ 检测限
本标准的检测限见表１。
表１ β内酰胺类药物检测限
β-内酰胺类药物名称 | 牛奶的检测限/(μg／kg) | 肉类、鱼和虾的检测限/(μg／kg) |
苄青霉素 | 4 | 20 |
氨苄青霉素 | 4 | 20 |
羟氨苄青霉素 | 4 | 20 |
邻氯青霉素 | 20 | 200 |
双氯青霉素 | 20 | 200 |
苯唑青霉素 | 20 | 200 |
头孢噻呋 | 100 | 800 |
SN/T 2127-2008进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法
附 录 A
（规范性附录）
培养基
A.１ 细菌保存培养基
A.１.１ 成分
胰蛋白胨 １５．０ｇ
植物蛋白胨 ５．０ｇ
氯化钠 ５．０ｇ
琼脂 １５．０ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
ｐＨ ７．３±０．２
A.１.２ 制法
将各成分加热溶解，分装试管，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，制成斜面。
注：制成半固体时，琼脂量为０．５％。
A.２ 菌种芽孢培养基
A.２.１ 成分
胰蛋白胨 １７．０ｇ
植物蛋白胨 ３．０ｇ
氯化钠 ５．０ｇ
磷酸氢二钾 ２．５ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
琼脂 ２０ｇ
ｐＨ ７．３±０．２
A.２.２ 制法
将各成分加热溶解，分装３００ｍＬ 于克氏瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。
A.３ 检定培养基
A.３.１ 成分
牛肉膏 ３．０ｇ
蛋白胨 ５．０ｇ
大豆蛋白胨 ０．３ｇ
葡萄糖 ５．２５ｇ
氯化钠 ０．５ｇ
磷酸氢二钾 ０．２５ｇ
吐温-８０ １．０ｇ
溴甲酚紫 ０．０６ｇ
琼脂 １５．０ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
ｐＨ７．８±０．２
A.３.２ 制法
０．６％溴甲酚紫溶液配制：称取０．６ｇ溴甲酚紫溶于１００ｍＬ 蒸馏水中。将各成分加热
溶解，分装每瓶１００ｍＬ，每瓶中加入０．６％ 溴甲酚紫溶液１ｍＬ，１２１ ℃ 高压灭
菌１５ｍｉｎ。