SN/T 2127-2008进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法
进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物
残留检测方法 微生物抑制法
1 范围
本标准规定了动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。
本标准适用于牛奶、肉类、鱼和虾中的苄青霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、苯唑青霉素和头孢噻呋等药物残留筛选检测,阳性结果应用其他方法进行确证。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/B 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-2208,ISO 3696:1987,MOD)
3 试样制备和保存
3.1 试样制备
3.1.1 牛奶:取不少于500 mL 试样,装入清洁容器内,并标明标记。
3.1.2 肉类、鱼和虾:从原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速捣碎机均质,充分混匀,用四分法缩分不少于500g试样。装入清洁容器内,并标明标记。
3.1.3 制样操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3.2 试样保存
3.2.1 牛奶:0℃~4 ℃保存。
3.2.2 肉类、鱼和虾:试样于-18℃以下保存,新鲜或冷冻组织样品可在2℃~6℃保存72h。
4 测定方法
4.1 方法提要
试样经缓冲液提取、温育和离心后,取上清液进行测定。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试
样中是否含有抗生素。
4.2 设备和材料
4.2.1 恒温箱:63 ℃±1℃。
4.2.2 离心机。
4.2.3 高速组织捣碎机。
4.2.4 恒温水浴锅:80℃。
4.2.5 涡旋振荡器。
4.2.6 显微镜:10×~100×。
4.2.7 游标卡尺:测量范围0mm~200mm,精度0.02mm 或抑制圈测量仪。
4.2.8 灭菌平皿:直径90mm,底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。
4.2.9 圆形滤纸片:直径10mm,厚1.1mm。日本Toyo Roshi Kaisha,Ltd.产品或同类产品。
4.2.10 克氏瓶。
4.2.11 可调移液器:10μL~100μL,100μL~1000μL。
4.3 菌种和培养基
4.3.1 菌种
嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilusATCC10149。
4.3.2 培养基
4.3.2.1 细菌保存培养基:见附录A 第A.1章。
4.3.2.2 菌种芽孢培养基:见附录A 第A.2章。
4.3.2.3 检定培养基:见附录A 第A.3章。
4.4 试剂
除非另有说明,本标准所用化学试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T 6682的规定。
4.4.1 1.0 mol/L盐酸溶液
量取90mL 浓盐酸用蒸馏水稀释至1000mL。
4.4.2 1.0 mol/L氢氧化钠
准确称取4.0g氢氧化钠,溶解于100mL 蒸馏水中。
4.4.3 缓冲液
4.4.3.1 pH6.0 磷酸盐缓冲液:称取8.0g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)及2.0g磷酸氢二钾(K₂HPO₄.3H₂O),用蒸馏水溶解并定容至1000mL,121 ℃高压灭菌15min。
4.4.3.2 磷酸盐缓冲液丙酮
磷酸盐缓冲液丙酮:按体积比pH6.0磷酸盐缓冲液∶丙酮=1∶1比例制备。
4.4.4 抗生素标准液
4.4.4.1 标准品:苄青霉素,纯度≥99%。
4.4.4.2 苄青霉素标准储备液:准确称取适量的苄青霉素标准品,用灭菌pH6.0 磷酸盐缓冲液
(4.4.3.1)溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8 ℃冰箱保存,贮存期7d。
4.4.4.3 苄青霉素标准工作液:吸取适量的苄青霉素标准储备液,用pH6.0磷酸盐缓冲液(4.4.3.1)稀释成0.005μg/mL的标准工作液,应当日配制使用。
4.5 测定步骤
4.5.1 样液提取
4.5.1.1 牛奶:取20mL 鲜奶于50 mL 离心管,3000r/min 离心5 min,除去上层脂肪层,以1.0mol/L盐酸溶液或1.0mol/L 氢氧化钠调节pH 至6.5~7.0。脱脂奶可直接用于检测。
4.5.1.2 肉类、鱼和虾:称取10.0g 均质好的试样于50mL 离心管中,加入磷酸盐-丙酮缓冲液10mL,用涡旋振荡器充分振荡3min,于80 ℃水浴保温30min后,3000r/min离心15min取上清液作为样液。
4.5.2 菌悬液的制备
嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149菌悬液:一般情况下,菌种的传代次数不应超过5代,否则在每次
使用前确证其生化特性没有发生变异,或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后,将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中,55 ℃±1 ℃培养72h镜检芽孢数达80%以上(如果达不到,可再培养数日,芽孢数仍达不到要求,菌种可能变异,不可使用),用灭菌生理盐水洗下菌苔,使其悬浮于生理盐水中,80 ℃水浴加热30 min,经3000r/min离心20 min,弃去上清液,如此重复洗涤芽孢两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液,用稀释平板计数的方法或比浊法进行计数以确定菌种的浓度。置2 ℃~8℃冰箱保存,贮存期30d。
4.5.3 检定用平板的制备
将试验菌悬液按一定的比例加入到融化后冷却至60℃左右的灭菌检定培养基中充分混匀后,使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×10⁶CFU/mL。在灭菌平皿中加入6mL 混合液,保持水平待其凝固。取制备好的检定用平板两个,分别放置两个滤纸片,加入约90μL(以纸片吸满为准)0.005μg/mL苄青霉素标准工作液,冷藏放置30min后,63 ℃±1 ℃培养3.5h能产生14mm 以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格,达不到要求的平板应弃去。制备好的平板置2 ℃ ~8 ℃ 冰箱可保存2d~3d。
4.5.4 测定
取制备好的检定用平板两个,在平板底部作好标记,将滤纸片适当间隔置于平板上,每个平板最多不超过6个,在其中一个滤纸片加入约90μL(以纸片吸满为准)0.005μg/mL 苄青霉素标准工作液作为阳性对照,其余的滤纸片中加入约90μL 样液,冷藏放置30min后,63 ℃±1 ℃培养3.5h后开始观察,如果0.005μg/mL 苄青霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且大于14mm 时终止培养,记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做两个平板上的平行试验。
4.6 检测结果判断和报告
4.6.1 如果样液在平板上无抑菌圈,0.005μg/mL 苄青霉素标准工作液的抑菌圈直径大于14mm,即报告“阴性”。
4.6.2 如果样液在平板上呈现抑菌圈,抑菌圈直径在13mm 以上,即报告“初筛阳性”。
4.6.3 如果样液在平板上呈现抑菌圈,抑菌圈直径小于13 mm,大于10 mm,或者两个平行结果不一致时,视为可疑,应重新测试后判定。
4.6.4 阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。
5 检测限
本标准的检测限见表1。
表1 β内酰胺类药物检测限
β-内酰胺类药物名称 | 牛奶的检测限/(μg/kg) | 肉类、鱼和虾的检测限/(μg/kg) |
苄青霉素 | 4 | 20 |
氨苄青霉素 | 4 | 20 |
羟氨苄青霉素 | 4 | 20 |
邻氯青霉素 | 20 | 200 |
双氯青霉素 | 20 | 200 |
苯唑青霉素 | 20 | 200 |
头孢噻呋 | 100 | 800 |
SN/T 2127-2008进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法 微生物抑制法
附 录 A
(规范性附录)
培养基
A.1 细菌保存培养基
A.1.1 成分
胰蛋白胨 15.0g
植物蛋白胨 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
pH 7.3±0.2
A.1.2 制法
将各成分加热溶解,分装试管,121℃高压灭菌15min,制成斜面。
注:制成半固体时,琼脂量为0.5%。
A.2 菌种芽孢培养基
A.2.1 成分
胰蛋白胨 17.0g
植物蛋白胨 3.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 2.5g
蒸馏水 1000mL
琼脂 20g
pH 7.3±0.2
A.2.2 制法
将各成分加热溶解,分装300mL 于克氏瓶内,121℃高压灭菌15min。
A.3 检定培养基
A.3.1 成分
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
大豆蛋白胨 0.3g
葡萄糖 5.25g
氯化钠 0.5g
磷酸氢二钾 0.25g
吐温-80 1.0g
溴甲酚紫 0.06g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
pH7.8±0.2
A.3.2 制法
0.6%溴甲酚紫溶液配制:称取0.6g溴甲酚紫溶于100mL 蒸馏水中。将各成分加热
溶解,分装每瓶100mL,每瓶中加入0.6% 溴甲酚紫溶液1mL,121 ℃ 高压灭
菌15min。