人髓鞘碱性蛋白抗体(MBP-Ab)ELISA试剂盒说明书

人髓鞘碱性蛋白抗体(MBP-Ab)ELISA试剂盒仅供研究使用

预期应用:ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中MBP 抗体含量。

说明:

1.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

2.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

3.浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。   

4.试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。

实验原理:用纯化的MBP蛋白抗原包被微孔板，制成固相载体，向微孔中分别加入待测样品，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人的抗体进行反应，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MBP Ab呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品中抗体的效价(抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价)。 

人髓鞘碱性蛋白抗体(MBP-Ab)ELISA试剂盒组成及试剂配制: 

1.酶联板(Assay plate )：一块(96孔)。 

2.样品稀释液(Sample Diluent)：2×20ml/瓶。

3.辣根过氧化物酶标记二抗(HRP-anti-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)

4.底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。 

5.浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 

6.终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的试剂和器材:

1.标准规格酶标仪

2.高速离心机

3.电热恒温培养箱

4.干净的试管和Eppendof管

5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器

6.蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存:

1.血清：全血标本请于37° C放置1小时或4° C过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

辣根过氧化物酶标记二抗的稀释原则：临用前用样品稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记二抗加990μl样品稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤:

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释。

1.加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔加待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60分钟。

2.弃去液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔。每孔加辣根过氧化物酶标记二抗工作液 100μl(按1μlHRP标记抗体加99μl样品稀释液的比例配制，轻轻混匀)。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

4.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见阳性孔内有明显蓝色，即可终止)。

5.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

注：

1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 

3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。辣根过氧化物酶标记二抗工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记二抗工作液。

5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法:

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

计算:为检测样品中MBP蛋白抗体效价，客户可以采取样品2倍倍比稀释样品计算抗体效价，一般采取以1:40为起始稀释倍数(使用样品稀释液进行稀释)。最大稀释倍数根据客户自身试验要求而定，最终显色与阴性对照孔进行比较，有明显差异的最大稀释度定为抗体的最终效价。

注意事项:

1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

2.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

3.一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5.底物请避光保存。

6.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的人MBP抗体，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期:6个月