枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

一、实验目的

1、观察D-半乳糖所致的小鼠老年痴呆的症状及探讨枫荷桂提取物、他克林的疗效的比较。

2、测定小鼠的学习记忆能力是否有所变化，同时测定其血液的SOD（超氧化酶歧化酶）活性及大脑匀浆胆碱酯酶的活性，并做海马区的老年斑测定。

二、实验原理

1、D-半乳糖腹腔注射可模拟AD氧化损伤，导致小鼠学习记忆下降、脑内胆碱能系统功能衰退、神经递质代谢异常、皮层和海马神经元损伤、超微结构和突触可塑性发生衰退性改变及Aβ淀粉样蛋白的沉积，病变与AD病变类似，可用于诱导建立AD模型鼠。

2、SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果，Aβ淀粉样蛋白的沉积会对大脑产生毒素作用，引起血液中SOD的改变。邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm)，同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量

3、血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后乙酰羟胺与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物，颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在520nm波长比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

4、Morris水迷宫测定小鼠的学习记忆能力，虽然老鼠是天生的游泳健将，但是它们却厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，他们会本能的寻找水中的休息场所。寻找休息场所的行为涉及到一个复杂的记忆过程，包括收集与空间定位有关的视觉信息，再对这些信息进行处理、整理、记忆、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隐藏在水中的站台，最终从水中逃脱。通过水迷宫视频分析系统能得到小鼠空间记忆的相关数据。

5、避暗法，穿梭箱为长方形盒（50cm×23cm×30cm），用一带门（7cm×5cm）隔板分成安全区和电击区，电击区底部为可通电的铜栅栏（间隔0.5 cm），顶部有一声源，实验分为训练和正式测试两部分，挑选对电击反应较为一致的小鼠进行训练，将小鼠放入穿梭箱内适应环境1min，然后置于电击区，以声音为条件刺激，响10s后，以电击（40V）为非条件刺激，使小鼠逃向安全区。训练期4d，每天10次，每次间隔2-3 min.d5进行正式测试，观察10次反应，在声音10s内进入暗室为主动回避反应阳性，记录从声音到小鼠进入暗室的时间（主动回避），10s内不主动回避，给以电击后进入暗室为被动逃避，记录被动逃避次数。通过此装置能得到小鼠受刺激记忆的数据。

6、AD主要表现为认知和记忆障碍，而认知和记忆障碍的主要解剖基础为海马组织结构的萎缩及病变，功能基础主要为胆碱能神经兴奋传递障碍和中枢神经系统内乙酰胆碱受体变性。胆碱酯酶抑制剂（如他克林）能改善中枢胆碱能神经功能。

6、阿尔茨海默(AD)的主要病理学特征是海马和皮层出现大量的细胞外老年斑(SP)。生化研究表明,SP的主要成分为-淀粉样蛋白(AP),它与AD的病理形成过程关系密切。老年斑为细胞外结构，直径为20~150μm，多见于内嗅区皮质，海马CA-1区，其次为额叶和颞叶皮质。其中心为淀粉样蛋白，周围由刚果红染色染成红色。

三、老年痴呆症状

   老年痴呆又称尔茨默病 （lzheimer' disease, D)是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid,β-AP)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque, P)的形成

四、药物的疗效作用

1、他克林为胆碱酯酶抑制剂，能抑制血浆中的AchE,又可抑制组织中的AchE。能改善小鼠的学习记忆功能，且能有效的减少大脑老年斑的数量，以能提高血浆中SOD及乙酰胆碱的的活性。

2、枫荷桂的药效有实验结果数据分析得。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

五、实验材料

1、器材：鼠笼，注射器，试管，容量瓶，灌胃器，恒温水浴锅，紫外分光光度计，液体快速混合器，水迷宫视频跟踪分析系统，小鼠避暗仪，离心机，切片机，匀浆器。

2、药品：D-半乳糖，吡拉西坦，枫荷桂提取液

3、试剂：苦味酸; 三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、HCl、邻苯三酚; 酒精、冰醋酸、苏木精、甘油、钾矾（硫酸铝钾）、伊红、刚果红、甲醇、蛋白、水杨酸钠（防腐剂）、戊巴比妥钠、生理盐水、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、氢氧化钾、树胶、石蜡 ; 磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸羟胺，氢氧化钠，浓盐酸，三氯化铁，蒸馏水，乙酰胆碱，草酸钾。

4、动物:昆明品系健康小白鼠48只

六、实验方法

实验前准备

1、分组

小鼠48只，体重18~22g，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、枫荷桂提取物组、他可林组四个组，每组12只，对每组和每只小白鼠做好标记。实验前，将所有实验用的小白鼠在实验室内饲养1周，使其熟悉实验环境，自由饮水和取食， 饲养条件安静和较暗，室温20～25℃。

2、给药

①对照组灌胃生理盐水0.25lm/d，模型组、枫荷桂提取物组、他可林组均每日腹腔注射120mg/kgD-半乳糖，枫荷桂组每日按10g/kg灌胃，他可林组每日按3g/kg灌胃，进行30天，每3天测定一次小鼠的学习记忆能力，每天每只测2次。

②D-半乳糖注射液：可以网购的吧

枫荷桂：30g提取物溶于水中，定容到75ml得灌胃液。

  他可林：药店应该有得卖。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

③药品总量：

枫荷桂提取物：10g/kg×（0.02kg×10只）×30天=60g

他克林：3g/kg×（0.02kg×10只）×30天=18g

D-半乳糖：120mg/kg×（0.02kg×10只）×3组×30天=72g

3、取样

①血液及脑匀浆：每组取5只，小鼠禁食12h，断头处死，取血，之后取全脑(嗅脑除外)，置匀浆器中，加入预冷生理盐水制成10g／m1脑匀浆，3000r／min离心10min，取上清液置冰浴中，按部分测定方案测脑匀浆AchE、血液SOD活性。

②脑切片组织：，每组余下小鼠动物经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,剪开胸廓,经心尖插管至主动脉根部,先用生理盐水快速灌注冲洗,随后灌入固定液4%多聚甲醛,开颅取脑，置4%的甲醛溶液中固定24h。按石蜡包埋切片方法制备切片。

实验步骤

一、建模

   Morris水迷宫试验

1、大鼠在造模前均进行水迷宫游泳训练，训练至整个游泳从起始到找到平台所需时间连续3次都小于10s为获得记忆。

2、实验组小鼠每日按120mg/kg空腹腹腔注射D-半乳糖，连续注射4周。对照组注射等量生理盐水。

3、注射3周后对动物进行Morris水迷宫测试，在同一时间上再重新进行水迷宫游泳实验，小鼠寻找并爬上平台所需要的时间为逃避潜伏期，共3次，计算平均成绩。

注意：水迷宫实验环境要求安静，避免外界干扰，室内日光灯照明，水温25℃，一般时间选择在13：00—17：00，19：00—21：00。

避暗实验

正式实验前对各组小鼠进行训练，将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3min，然后给暗室铜栅通36V电流，小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5min，此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间（避暗潜伏期），若小鼠5min内仍未进入暗室，其潜伏期计作300s。

二、采血测定SOD及胆碱酯酶含量

腹腔注射D-半乳糖之前对小鼠进行一次采血测定SOD及胆碱酯酶含量，作为空白对照。建模成功后，进行正常采血。

                   SOD含量的测定

1、邻苯三酚自氧化速率的测定

取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

2、SOD样液的活性测定

样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。

3计算

                 胆碱酯酶的测定

1、试剂配制

①磷酸盐缓冲液（PH=4.5）：准确称取4.156g磷酸氢二钠和1.3617g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释到500ml，保存冰箱内。

②碱性羟胺溶液：临用前将139g∕L盐酸羟胺溶液和140g∕L氢氧化钠溶液等体积混合。

③4mol∕L盐酸溶液：量取比重1.19的浓盐酸100ml，加蒸馏水至300ml。

④10%三氯化铁溶液：10g三氯化铁，加蒸馏水10ml，浓盐酸0.84ml，加蒸馏水至100ml，存于棕色瓶中备用。

⑤乙酰胆碱标准液：精确称取乙酰胆碱1.，用磷酸缓冲液（PH=4.5）溶解，并稀释到100ml，此溶液1ml相当于70umol乙酰胆碱，为贮备液。临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液（PH=4.5）稀释10倍，此时溶液1ml相当于7umol乙酰胆碱，为应用液。2716g

⑥草酸钾抗凝剂：取草酸钾10g，加蒸馏水少许使溶解，再加蒸馏水至100ml。配制成10％水溶液，如每管加0.1ml则可使5~10ml血不凝。一般如作微量检验，用血量较少，可配制成2％溶液，如每管加0．1ml可使1~2ml血液不凝。

按照师姐的测定方法测定。

三、石蜡切片制备及老年斑染色

实验程序：

1、取材

采血测试完毕后,次日动物经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,剪开胸廓,经心尖插管至主动脉根部,先用生理盐水快速灌注冲洗,随后灌入固定液4%多聚甲醛,开颅取脑，置4%的甲醛溶液中固定24h。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的脑组织，切成一小块2~3mm厚。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

取材的注意事项：

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2、固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。

固定的注意事项：

（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3、 洗涤

材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。

4、 脱水

30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。

脱水注意事项：

（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。

（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5、透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

6、透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；

（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

7、 包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。

用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

包埋的操作过程枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

8、 切片

①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。

⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

9、 贴片

①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成

均匀薄层。枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究

②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。

③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸馏水中3min。

染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。

11、染色

①刚果红染色：SP老年斑一般用刚果红染色，也可以用硝酸银染色。老年斑的染色方法是：Highman甲醇刚果红染色法。
1.甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
2.碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
染色步骤:1. 切片脱蜡至水2. 甲醇刚果红染液染10～20分钟3. 用碱性乙醇分化液分化数秒4. 水洗5. 苏木素复染2分钟6. 水洗. 脱水,透明,封固7结果：淀粉样物呈桔红色

②H.E.对染法：

1、切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

2、水洗

用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

3、分化

就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。

4、漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。

5、脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

6、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞

核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

7、脱水Ⅱ：

放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

12、透明

切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

13、封藏：中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。

封藏的方法：

封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

四、统计分析：所有数据以平均数和标准差表示，数据统计分析使用SPSS13.0统计软件进行组间t检测和单因素方差分析比较组间差异，p＜0.05为差异具有显著性，p＜0.01为具有非常显著的差异。

4、经费预算

①雌雄各半，小白鼠一只7元，48只就338元。路费一去一回（火车45+汽车65）110元。

②测AchE总需         ，测SOD总需，切片部分总需（有蛮多药品查不到价格，没有得出预算。）