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人抗白蛋白抗体ELISA试剂盒应用方法
2012/10/13 3:01:20
浏览：640
本试剂仅供研究使用
试验原理：
AAA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知AAA浓度的标准品、未知浓度的样品 加入微孔酶标板内进行检测。先将AAA和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中AAA的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制：
试剂盒成份 96孔配置 48孔配置
96/48人份酶标板 1块板（96T） 半块板（48T）
塑料膜板盖 1块 半块
标准品：200ng/ml 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）
空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）
标准品稀释缓冲液 1瓶（8.0ml） 1瓶（4.0ml）
生物素标记的抗AAA抗体 1瓶（8.0ml） 1瓶（4.0ml）
亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml） 1瓶（5ml）
洗涤缓冲液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml）
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）
终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）
自备材料：
1. 蒸馏水。
2. 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3. 振荡器及磁力搅拌器等。
4.
样品收集、处理及保存方法：
血清……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原
和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红
细胞迅速小心地分离。
2、 血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液……1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。
5、 保存……如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作注意事项：
● 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
● 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
● 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
● 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
● 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
● 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
● 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
● 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
安全性：
避免直接接触终止液和底物A、B，一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
试剂的准备：
标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
200
ng/ml （6号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul
100
ng/ml （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
50
ng/ml （4号标准品） 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
25
ng/ml （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
12.5
ng/ml （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
6.25
ng/ml （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0
ng/ml （空白对照） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul
洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
试剂盒性能：
灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
特异性：不与其它细胞因子反应。
重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
操作步骤：
使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
在450nm波长处测定各孔的OD值。
结 果 判 断 与 分 析：
仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的AAA标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的AAA含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
检测值范围： 0-200ng/ml
敏感度：0.1ng/ml