利用高效液相色谱法分析渔药残留样品处理 摘要：近年来水产养殖业在国内迅速发展，为加大鱼的产量养殖者通常会使用抗生素等药物，这些药物由于价格低廉、抗菌谱广等诸多优点被广泛采用。如长期食用将会对人体产生耐药性。该问题引起各国专家密切关注，而高效液相色谱对大多数药物而言，能满足检测要求。

　　我国水产养殖业发展迅猛，由于养殖集约化程度提高，养殖病害日益严峻，各类药物在生产中广泛使用，水产品药物残留问题日益突出。为加大鱼的产量，养殖者 常使用抗生素类药物及合成抗菌药物。这些渔药由于抗菌谱广、价格低廉等诸多优点而被广泛采用。但其在鱼体内的残留会使鱼类自身连同其食用者产生耐药性，有 些残留药物将进一步破环养殖水体环境，而鱼的品质降低也直接影响到鱼食品进出口贸易——该问题已引起世界各国专家的密切关注[1~3]。在鱼体内残留的抗 生素具有痕量、动态、浓度波动范围大、样品基质复杂且不确定、干扰物质多等特点，因此很大程度上不同于普通的药物分析，要求分析技术能同时满足灵敏度高、 选择性、分离能力强、线性范围宽等特点。现有检测方法众多[4]，主要有微生物测定法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用和液质联用等。 其中，高效液相色谱(HPLC)具有灵敏度高、分离速度快、对抗生素残留能准确定量等优点，能满足检测要求。对大多数渔药而言，RP-HPLC是标准的分 离方法，易操作，易获尖锐的峰形而分离效果良好。使用HPLC法检测残留药物通常需要经过样品处理、残留药物分离和检测三个步骤。由于分离和检测技术日臻 完善，现代色谱仪器对一个样品的分析测定所需时间越来越短[5];但样品制备过程所用的时间仍然很长，成为研究的瓶颈。利用高效液相色谱法分析渔药残留样品处理，在众多的样品前处理方法中，各种无 (少)溶剂样品处理技术已成为仪器分析中主要的样品前处理方法。本文介绍国内外新兴样品处理技术，并对鱼肉中常见的抗菌类残留物的样品提取技术予以综述。

　　1样品处理方法简介

　　样品处理过程一般包括样品的采集、提取、净化和衍生化[6]。测定鱼类抗生素残留的采样对象通常为鱼肉，采集后的样品应防腐存贮。通常采用液固提取 (Liquid-SolidExtraction,LSE)法提取样品，一般使用水和酸化有机溶剂，以此达到同时脱蛋白和萃取抗生素的目的。常用提取方法 有匀浆提取法、振荡法、索氏提取法等[7]。通常所得提取液中含有许多与待测组分溶解性相似的杂质或共萃物，需进行净化与浓缩。对于部分组分还需经过化学 衍生化处理，使适合于特定分析条件的化合物[8]。近年来，一系列新兴处理技术正迅速崛起[9]，使传统的提取、净化和浓缩等步骤更加简捷，测量更准确。
　　1.1固相萃取类

　　固相萃取(Solid-PhaseExtraction,SPE)是目前渔药残留分析中样品前处理的主要技术[10]。SPE法用固体物质作为萃取剂吸 附液体样品中的目标化合物，将待测组分和干扰化合物分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。SPE既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合 物的提取，又可用于净化、浓缩或富集，仅需使用少量的有机溶剂，能净化小体积(50~100μL)样品，简化样品处理过程，降低费用。

　　基质固相分散(MatrixSolid-PhaseDispersion,MSPD)技术避免使用萃取溶剂，是真正意义上的固相萃取，可同时分散和萃取 固体、半固体样品。MSPD法采用小样品容量与少量固相吸附剂(通常使用C8或C18材料)一同研磨，得半干状态的化合物作为填料装柱，再用不同的溶液淋 洗柱子，将各种待测物洗脱下来。该技术浓缩传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免样品中被测物的损失，操作简单且易实 现自动化[11]。

　　1.2超临界流体萃取

　　超临界流体萃取(SFE)是近30年发展起来的一种新型样品富 集技术[12]，基于在临界点附近，流体温度和压力的微小改变均可导致其性质的显著变化，可用作溶剂进行物料萃取。超临界CO2是最为常用的萃取剂。该技 术不使用或少量使用有机溶剂，环境友好，且萃取速度快、效率高、能耗少、成本低及安全性好，还可与HPLC等分析仪器离线联用。

　　1.3免疫亲和技术

　　免疫亲和色谱技术(ImmunoaffinityChromatography,IAC)和多残留免疫亲和色谱(Multi- ImmunoaffinityChromatography,MIAC)是目前净化和富集效能最强的样品处理技术。IAC根据分析物和其他所引起的抗体之 间有选择的和可逆的相互作用从而从复杂样品基质中分离出分析物[13]，简化处理过程，大大提高选择性，使分析结果更加准确和可靠，特别适用于食品安全检 测中的农药残留和兽药残留等检测限非常低的痕量检测。IAC正从离线分析向在线分析、从单残留分析向多残留分析发展。在其基础上，发展多残留免疫亲合色谱 (MIAC)技术：将多种抗体或簇特异性抗体固定到一根柱子上，或将固定有不同抗体的不同柱子串联起来，同时对多种目标组分进行净化浓缩，使免疫分析技术 实际具备处理复杂样品中多组分残留的能力。但两者均处于探索阶段[14]，尚不成熟。

　　1.4其他样品处理方法

　　其他微波辅助提取、超声降解、气体萃取、膜萃取、快速溶剂萃取(AcceleratedSolventExtraction,ASE)等无(少)溶剂萃 取方法亦见报导[15]。其中，ASE是在提高温度(50~200℃)和压力(10~30MPa)的条件下，用有机溶剂萃取固体或半固体样品的自动化方 法。提高温度可降低样品基质对分析物的作用，加快被分析物从基质中解析并快速进入溶剂，降低溶剂粘度利于溶剂分子向基质中扩散;提高压力可提高溶剂沸点， 确保溶剂在萃取过程中始终保持液态。其突出优点是有机溶剂用量少、萃取速度快、回收率高。该法已被美国环保局选定为推荐的标准方法。

　　上述处理技术较之传统处理技术优点显著，特别适用于大批量样品或多残留分析，以简化前处理过程、缩短前处理时间，达到提高检测效率的目的。

　　2常见渔药残留的样品处理和HPLC检测

　　鱼类养殖者常用的抗生素类药物主要有四环素、氯霉素类、大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类和硝基咪唑类等。在样品处理时，需要考虑组分的物理化学性质、存在 状态、样品基质的化学组成、可能的干扰物质物类型、处理方法对组分稳定性的影响和采用的测定方法。方法是否理想要看药物组分添加回收率高低、干扰成分去除 程度、提取步骤的繁简等因素来综合评定。样品处理方法涉及的因素很多，操作复杂，方法灵活，直接影响分析结果的准确性和精密度，以及方法的效率和成本，应 合理选用。以下针对几类鱼类养殖中的常用抗生素的检测方法做综述。

　　2.1四环素类(TCs)四环素类抗生素 (tetracyclines,TCs)是鱼类养殖中一类重要的抗感染药物，水溶性好、化学性质稳定、治疗效果好且成本低，可用于动物感染预防、治疗和饲 料添加剂以促进其生长，尤以土霉素(oxytetracycline,OTC)、四环素(tetracycline,TC)、金霉素 (chlortetracycline,CTC)和强力霉素(doxycycline,DC)应用最多[16]。但TCs易在骨骼和牙齿中沉积，亦可在肝 组织中富集，造成肝损害。因此准确检测四环素类抗生素的方法尤其重要。我国国家标准《畜、禽肉中土霉素、四环素和金霉素残留量的测定(高效液相色谱法)》 中[17]采用的样品处理和检测方法为：乙腈做提取剂，提取液经0.45μm微孔滤膜过滤。后用RP-HPLC法分离，经紫外检测器(UV)检测，三者的 检出限分别为150μg/kg，200μg/kg和650μg/kg。常采用SPE和MSPD技术对于含TCs残留鱼肉样品进行处理，其检出限低于国家标 准。

　　CarignanG[18]等用1%偏磷酸提取鱖鱼肌肉中土霉素，正己烷萃取去除脂肪，检测限85μg/kg，定量回收率 78.5%。杨挺[19]、黄志勇[20]等分别建立一种高效液相色谱法测定水产品中TCs分析方法，用5.0%高氯酸溶液提取样品，固相萃取柱净化上清 液，紫外检测器于355nm测定。最低检出限可达10μg/kg，适用于水产品中四环素类抗生素残留的检测。刘丽[21]、王覃[22]等采用类似方法， 分别用乙腈-柠檬酸溶液和乙腈-醋酸铵/醋酸/水缓冲液为流动相体系进行梯度洗脱，得到相似的检测结果。郭霞等[23]采用改进方法，使用5%高氯酸溶液 振荡提取，离心后经滤膜过滤，检出限为土霉素50μg/kg，四环素50μg/kg，金霉素100μg/kg，避免相对繁琐的MCI缓冲溶液配置过程和 SPE净化处理过程，使样品处理方法得到简化，且检出限稍高，低于国标检出限[24]。另有宋欢等[25]报导兔肉中TCs类药物的MSPD-HPLC- UV分析法。实验通过样品和C18填料研磨混合、装柱、淋洗、富集、RP-HPLC测定，可同时检测兔肉中4种TCs残留，检出限为10μg/kg，加标 回收率为69.8%~103.1%。该法灵敏、准确、简便、检测限低，研究者认为该法可普遍适用于水产品中上述4种TCs残留的同时检测。

　　2.2氯霉素类(CAPs)

　　氯霉素类抗生素(Chloramphenicols，简称CAPs)包括氯霉素及其衍生物，有氯霉素(Chloramphenicol,CAP)、甲砜 霉素(Thiamphnicol,TAP)、氟甲霉素(Florfenicol,FF)等。CAPs是一种强力广谱抗生素药品，人体若不断摄取将抑制骨髓 功能，引起人类的再生障碍性贫血等疾病;还能引起视神经炎、皮疹等不良反应;低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。世界粮农组织和卫生组织对食品中氯霉素 的残留量作出严格的规定，我国农业部也于2002年正式将氯霉素及其盐酯等制剂列为禁用药。对此类样品处理必须仔细谨慎，以提高测定的准确性和灵敏度，可 用传统方法或SPE法处理样品。Russel[26]首先报道HPLC法检测CAP残留。用乙腈和硫酸钠提取肌肉组织中的CAP，用正己烷去除脂类物质乙 腈相浓缩后经HPLC分析，检测限为1.0μg/kg。陈眷华等[27]用乙酸乙脂超声波提取鱼肉中残留TAP，用正己烷去脂，流动相为甲醇-水，C18 色谱柱分离检测，最低检测限为50μg/kg。赵芸等[28]用乙酸乙酯提取鱼肉样品中的FF，氮气吹干浓缩，液-液分离净化，经RP-HPLC法测定 FF，最低检出浓度为50μg/kg。目前HPLC法检测CAPs灵敏度高、重复性好，假阳性少，但检出限高[29]。样品处理主要使用乙腈和乙酸乙酯， 多用C18柱分析，而C8分析柱用于分析在C18柱上保留值低的化合物。在处理过程中还应注意样品和提取剂比例。黄志勇等[30]对市售罗非鱼、鳜鱼、黄 鳍鲷、鲈鱼、小黄花鱼、大黄花鱼、鳗鱼等进行试验，指出当鱼浆和提取剂为5∶14时，氯霉素基本被提取完全，提取溶剂过多和过少则结果均不理想。

　　2.3大环内酯类(MALs)

　　大环内酯类抗生素(macrolideantibiotics，MALs)是一庞大而重要的抗生素类群，目前已发现的达100多种，其共有的特征是抗革 兰氏阳性菌活性、抗支原体活性和低毒性。MALs的高残留会对人类造成致敏性及毒性反应，会改变人体肠道菌群的微生态环境，造成肠道菌菌群失调，亦易导致 细菌抗药性。世界各国对MALs的残留限量提出要求，并制定相应的残留监控计划。这类药残样品处理的基本方法为先用乙腈或甲醇提取，经正己烷洗涤脱脂，再 经SPE净化。国外有快速溶剂萃取-加压液相萃取(ASE-PLE)法，可考虑采用。刘晔[31]对基质较复杂的动物性食品样品中MALs的提取溶剂、固 相萃取柱等进行研究和条件优化。研究表明，较理想的方法是用甲醇作提取剂，振荡混合，超声提取，正己烷去除脂肪，使用磷酸盐缓冲液(pH6.0)超声溶解 抗生素，溶液经SPE柱净化，经HPLC分析。同时，研究者采用罗红霉素为内标，并将HPLC与电喷雾质谱联用，成功检测很难实现高灵敏度分析的红霉素和 竹桃霉素，检出限2~9μg/kg，定量限5~30μg/kg。张启迪[32]对鱼肉中残留阿维菌素(AVM)进行检测，用乙腈振荡提取样品，离心后残留 组织用乙腈提取，用碱性氧化铝SPE柱萃取，加入内标多拉菌素，浓缩过滤后HPLC分析，加内标液进行衍生化，检出限0.2μg/kg(按S/N=3 记)。HoudaBerrada[33]等对包括水产品等样品中MALs的残留情况进行检测研究，用丙酮作提取剂，经ASE-PLE处理，液质联用，同时 测得7种MALs的残留，检测限均低于15μg/kg。研究者建议该法可广泛用于与禽肉和鱼肉中该类药残的检测。

　　2.4磺胺类(SFs)

　　磺胺类药物(Sulfonamidesdrugs)是具有对-氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，用于预防和治疗细菌感染性疾病。此类药物的作用和代谢 时间均较长，且通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积并产生危害，主要表现为过敏反应、尿和造血紊乱，甚至致癌。因此，许多国家对此类药物在动物源 性食品中的残留进行严格监控。采用传统方法处理样品时背景干扰大，在浓度低时回收率低，影响检测结果，容易产生误判。相比传统方法，SPE是理想的样品处 理方式。

　　林海丹等[34]采用SPE前处理技术对鳗鲡及其制品中磺胺类残余物进行检测：以二氯甲烷为提取剂，所得产品中杂质少且 易除基质干扰;再用甲醇-1%乙酸-正己烷脱脂;采用阳离子交换固定相SPE柱，HPLC法分析，于250min内完成8种磺胺的完全分离，回收率为 80%~93%，定量测定低限为20μg/kg。该法简便、准确，效果理想，已被应用于广州口岸出口鳗鲡与烤鳗的实际检验中。张婉等[35]用HPLC法 检测罗非鱼肌肉中磺胺二甲基嘧啶的残留，样品采用C18-SPE柱，其准确度和精密度均比现有的标准方法SN0208-93出口肉中10种SFs残留量的 检测方法高。李孟玻等[36]用二氯甲烷提取鱼肉中5种SFs，正己烷脱脂，用SPE-C18色谱柱净化。检出限可达0.1μg/kg，样品加标回收率在 78.6%~87.6%之间。Theresa[37]等用二氯甲烷-丙酮(60∶40)提取食用鲶鱼、大马哈鱼等样品中的SFs，经对称C18分析柱，流 动相为0.2%乙酸-甲醇-乙腈。经LC-MS分析测定鱼肉中残留的磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶等14种SFs残留物，检出限为1μg/kg。该 法高效可靠，适用于同时检测多种SFs残留，但对设备和操作均有一定要求。