Morris水迷宫在血管性痴呆大鼠海马中的影响

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物健康SPF 级Wistar 大鼠80 只，购自南方医科大学动物实验中心，体重200 ～ 250 g，雌雄比例为1∶ 1，所有实验大鼠饲养于广州军区广州总医院动物中心，饲养房内温度( 22 ± 3) ℃，湿度60%，5 只/笼，光/暗周期为12 h /12 h，实验期间自由获取水及标准颗粒饲料。

1. 1. 2 主要试剂兔抗鼠5-HT6司，Envision 二步法检测试剂盒购自Dako 公司，二氨基联苯胺( DAB) 试剂购自福州迈新生物公司，其余化学试剂均为分析纯级。

1. 1. 3 主要仪器Morris 大鼠水迷宫，SuperMaze 动物行为学视频分析系统( 上海欣软信息科技) ，日本Olympus BX-51 显微镜， ImagePro plus 病理图文分析系统。

1. 2 方法

1. 2. 1 动物分组及模型制作所有大鼠适应性饲养1 w 后随机分成两组，VD 组50 只，假手术组( SO 组) 30 只。动物术前禁食、禁水4 h，称重后以10%水合氯醛按350 mg /kg 体重腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定后常规消毒颈部手术区域，在颈前正中作一长约1 cm 的纵形切口，钝性分离皮下软组织、颈前肌群，在气管的侧后方找到颈动脉鞘，分离颈总动脉与迷走神经，以1 号丝线永久性结扎颈总动脉，同法结扎另一侧颈总动脉，局部消毒后恢复组织层次并缝合皮肤。SO 组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，其余操作与VD 组大鼠一致。术后动物另放于干净鼠笼饲养，自由获取水源及饲料。

1. 2. 2 动物行为学观察( Morris 水迷宫实验) 大鼠Morris 水迷宫为一内径160 cm、高50 cm 的圆形水池，水池内壁被漆成黑色，池壁上黏贴不同形状的空间标记物，一个直径为12 cm的逃生平台固定于水池中的某一象限( 即目标象限) ，进水后水面高出平台约1 cm，水池上方横架安装连接计算机显示系统的摄像仪。

SO 组和VD 组大鼠分别在双侧颈总动脉阻断术后4、8 w进行Morris 水迷宫实验，第1 ～ 4 天( 即trial 1、trial 2、trial 3、trial4) 将大鼠从四个不同象限面向水池壁放入水中，大鼠找到逃平台后终止信息采集，最长采集时间为120 s，若超过120 s大鼠仍未能找到平台，则将其引导至逃生平台并在平台上站立20 s 以使其形成对空间参照物的记忆，每只大鼠如此训练4次/d，每次训练之间有15 s 间歇以便休息，连续训练4 d，记录大鼠找到平台的逃避潜伏期评估其空间学习能力; 第5 天将逃生平台从水池中撤去，将大鼠从四个不同象限投入水中，记录60 s 内大鼠在目标象限搜寻的时间，以此评估大鼠的空间记忆能力。每天固定在8: 00 ～ 17: 00 进行水迷宫实验，实验过程中保持房间内光照恒定并且无光线直射于水面，水温控制在26℃左右，迷宫外参照物保持不变。1. 2. 3 组织标本固定、制片、染色每组各取5 ～ 6 只大鼠分别在术后的相应观察终点麻醉动物，以4℃预冷4% 多聚甲醛溶液经心脏灌注固定，断头取脑后从视交叉后2 ～ 3 mm 处冠状位切取厚度约3 mm 的脑组织，放入10% 中性甲醛溶液中固定24 h。在自动脱水机中梯度酒精脱水、透明、浸蜡后包埋，蜡块组织作连续冠状切片，厚度2 ～ 3 μm。石蜡切片脱蜡、水化后分别进行苏木素-伊红( HE) 染色和Nissl 染色，在光学显微镜高倍镜( × 400) 下观察海马CA1 区锥体细胞计数及形态。

1. 2. 4 免疫组化显色分析海马CA1 区5-HT6受体的分布与表达石蜡切片经脱蜡、水化，置于pH6. 0 的柠檬酸盐中高压修复; 0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次，3% 过氧化氢溶液避光孵育10 min 以阻断内源性过氧化物酶，0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次，切片滴加兔抗鼠5-HT6受体多克隆抗体( 1∶ 1 000

稀释) ，置于湿盒内4℃ 冰箱中过夜孵育; 次晨取出切片0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次，滴加葡聚糖复合物( 二抗) ，室温下孵育40 min，0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次，滴加DAB 显色，显微镜下观察显色合适后流水冲洗终止反应，梯度酒精脱水、TO 生物透明剂透明，中性树胶封片后镜检观察。

1. 3 统计学方法应用SPSS13. 0 软件进行分析，计量资料采用x ± s 表示，两组独立样本均数比较采用t 检验，多个样本均数比较进行Levene 方差齐性检验，方差齐采用单向方差分析，方差不齐采用Brown-Forsythe 法; 平均逃避潜伏期和平均游泳速度在满足Mauchly 球对称检验时采用单个重复测量因素的方差分析，不满足Mauchly 球对称检验经Huynh-Feldt 系数校正自由度。

2 结果

2. 1 大鼠Morris 水迷宫结果术后4、8 w，SO 组和VD 组大鼠在定位航行试验中的平均游泳速度均无明显统计学差异( P ＞ 0. 05) 。术后4 w 和8 w，VD 组大鼠与同时间点SO 组大鼠平均逃避潜伏期比较均明显延长( P ＜ 0. 001) ，提示VD 组大鼠在术后无明显运动功能障碍，但存在空间学习能力减退，而且学习能力下降随脑缺血时间延长加重。术后4 w 空间探索试验中，SO 组和VD 组大鼠目标象限的平均搜寻时间比较具有统计学差异( P ＜ 0. 001) ，提示VD 组大鼠空间记忆能力下降。