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激光扫描多光子显微镜的改进优势
2014/3/7 16:11:40
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激光扫描多光子显微镜 是光学显微镜的重大改进，主要表现为可以观察活细胞、固定细胞和组织的深层结构，并且可以得到清晰锐利的多层Z平面结构，即光学切片，并以此可以构建出标本的三维实体结构。共聚焦显微镜是采用激光光源，经过扩充后充满整个物镜后焦平面，然后经过物镜的透镜系统，在标本的焦平面上会聚成非常小的点。根据物镜数值孔径不同，最亮照明点直径大小约0.25 ~ 0.8μm，深度约0.5 ~ 1.5μm。共聚焦点大小决定于显微镜设计、激光波长、物镜特性、扫描单元状态设定和标本性质。场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则集中到焦平面上的一个精确的焦点上。共聚焦显微镜最基本的优点是可以对厚荧光标本（可以达到50 μm或以上）进行精细的光学切片，切片的厚度约为0.5到1.5μm。系列光学切片图像可以通过精确的显微镜Z轴步进马达上下移动标本获得。图像信息的采集被控制在精确的平面内，而不会被位于标本上其他位置发出的信号干扰。在去除背景荧光影响和增加信噪比后，共聚焦图像的对比度和分辨率比传统场式照明荧光图像有明显的提高。在很多标本中，许多错综的结构成分相互交织构成复杂的系统，但是一旦能够采集到足够的光学切片，我们就能通过软件对其进行三维重建。这种实验方法已经被广泛应用于生物学研究中，用来阐明细胞或组织之间复杂的结构和功能关系。