实验试剂

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等

实验设备

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅等

实验步骤

1. 牛肉膏蛋白胨培养基的制备

   1) 计算  根据配方计算出实验中各种药品所需要的量，然后再分别称量。

   2) 称量  准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。

   3) 溶解  向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。

   4) 调pH值  用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

   5) 分装  根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1）。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

   6) 包扎  试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。

   7) 灭菌  培养基用0.1Mpa（15lb/in2）高压蒸汽灭菌15~20min，

2. 培养基的高压蒸汽灭菌

灭菌原理：水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力增加，水的沸点和温度也随之增加。因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。一般在0.1Mpa（15lb/in2）的压力时，温度可达121℃只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。

灭菌方法：

   1) 加水于灭菌器内到规定的水平面。

   2) 需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。

   3) 将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。

   4) 打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5~ l0min，关闭放气阀。

   5) 关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。

   6) 灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。

   7) 打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

   8) 灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。

3. 微生物的分离与纯化

借助于划线将混杂的细菌材料逐步稀释，最后在琼脂平板上分散开来，使之出现单一菌落而达到分离纯化的目的。

注意事项(牛肉膏蛋白胨培养基的制备、微生物的分离与纯化)

1. 要严格按配方配制。

2. 调pH不要过头。

3. 高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。

4. 划线法分离纯化微生物注意各区勿相互交叉。