摘 要:目的:观察4 周跑台运动对慢性应激致抑郁大鼠空间学习记忆能力，血浆皮质醇(Cortisol，cort)含量和海马 CA1 区脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotro-phic Factor，BDNF)表达的影响。方法:30 只 SD 大鼠随机分为正常对照组、应激模型组及应激运动组，制作慢性不可预见性应激模型，用八臂迷宫实验观察各组大鼠学习记忆等行为学指标的变化，放射免疫法测试大鼠血浆 cort含量，免疫组织化学结合图像半定量方法对海马 CA1 区BDNF 神经元的数量及面积进行测量和分析。结果:慢性应激致抑郁大鼠血浆 cort 含量增加，八臂迷宫实验中应激大鼠完成八臂迷宫时间显著延长，工作记忆错误次数、参考记忆错误次数及总记忆错误次数均显著增加，海马CA1 区 BDNF 表达减弱。而长期跑台运动可以显著改善抑郁模型大鼠的学习记忆能力，血浆 cort 含量降低，海马CA1 区 BDNF 表达增强。结论:跑台运动可改善抑郁模型大鼠的学习记忆能力，机理可能与长期运动降低抑郁大鼠的血浆 cort 水平、拮抗 HPA 轴功能亢进及增强海马CA1 区 BDNF 的表达有关。

关键词:跑台运动;抑郁大鼠;学习记忆;BDNF

抑郁症(depression)是一种潜在的致命的精神障碍性疾病，根据世界卫生组织统计全球超过1.21 亿人患有抑郁症，它的发病与逐渐增大的各种压力带来的应激性事件有关。慢性不可预知性应激(Chronic UnpredictableStress，CUMS)是近年来国内外应用最为广泛的抑郁动物模型之一，它可模拟抑郁的核心症状、快感缺乏及行为绝望，目前被广泛运用于抑郁症的病理生理机制、抗抑郁药物研发及作用机制的研究。研究发现学习记忆能力降低是抑郁症状的重要表现，许多实验表明一定程度的应激可以引起大鼠及人类学习记忆能力的减退，而运动锻炼能降低应激导致的啮齿动物的焦虑行为，改善动物的认知功能，但机制尚不清楚。海马是边缘系统的重要组成部分，是学习记忆和情绪整合的神经中枢，其结构损伤可能是抑郁症患者情绪低落和学习记忆能力下降的基础。BDNF(Brain DerivedNeurotrophic Factor)作为神经营养因子中的一份子，对神经元的发生、分化、存活和生长起着重要作用。近来研究显示，BDNF 在抑郁症等神经系统疾病的发病机制中发挥着重要作用，与焦虑、抑郁行为等有关。慢性应激引起海马形态学的改变研究较多的区域为海马 CA3 区，较少涉及海马 CA1 区，而且研究认为海马 CAl 区在动物的信息处理及空间记忆方面担负着尤其重要的作用。因此，本实验以海马 CA1 区为研究重点，通过复制 CUMS 大鼠模型观察跑台运动4 周后血浆cort 水平，测试大鼠学习记忆能力及海马 CA1 区 BDNF 表达的变化，探讨跑台运动改善抑郁模型大鼠学习记忆能力的可能机制。

1 材料与方法

1. 1 动物及分组

雄性健康成年 SD 大鼠 3 月龄 30 只，体重(200 ～220)克，室温(20 ± 2)℃，湿度(55 ± 10)% ，12 h 昼夜循环光照。大鼠购回后适应环境1 周，将30 只大鼠随机分为3 组:即正常对照组(C)、应激模型组(SM)及应激运动组(SE)，每组10 只，SM 组及 SE 组大鼠单独喂养。

1. 2 慢性不可预知性应激模型

制备慢性中等不可预知应激抑郁动物模型。应激刺激为24h 禁水、5min 悬尾、2h 束缚应激、5min 冷水强迫游泳(水温 4℃)、24h 禁食、昼夜颠倒、20min 电击足底(0. 8A，每次持续4s、间隔 5min)，共 7 种刺激，每日 1 种，每天1 次，以上刺激顺序随机安排，同种刺激不连续出现，且每种刺激在每一轮中出现的次序不同，连续4 周。非应激组大鼠除了必要的例行鼠笼清洁，不做任何干扰。

1. 3 跑台训练方案

①应激模型组大鼠从第二周开始每天上午接受为期四周的 CUMS 程序。②应激运动组大鼠每天上午接受 1次 CUMS 程序，下午进行跑台训练。跑台训练前大鼠进行1 周适应性训练，正式训练时，每天下午进行跑台运动，大鼠0 坡度跑台运动4 周，第(1-2)周大鼠每天运动30min(10m/min ×3)，第3 周每天运动45min(15m/min ×3)，第4 周每天运动 60min(15m / min × 4)，跑台训练期间每个程序之间大鼠休息5min。跑台训练时不使用电击装置驱赶大鼠，以避免对大鼠施加不良应激，为期4 周。③正常对照组:在整个实验过程中，正常对照组大鼠除了必要的例行鼠笼清洁，不做任何干扰。

1. 4 八臂迷宫实验程序

慢性应激刺激及跑台训练结束后第二天，所有大鼠进行八臂迷宫实验，实验前大鼠先在迷宫中适应2d，每天2 次。适应时 3 至 4 只大鼠同时置于迷宫中，自由活动和摄取食物10min，适应后进行每天2 次的训练。每次训练中，八臂中只有四臂放置了食物(分别为1、3、5、7 号臂)，整个实验过程均维持此顺序。实验前所有大鼠禁食 2d，正式实验时将大鼠置于迷宫中央区，中央区四周用鼠门关住，15s 后将门打开并开启分析测试软件，测试定时10min，大鼠可选择进入任意一臂，以摄取食物。大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为1 次正确选择;分析记忆的记录参数为错误选择的次数，重新进入放食物臂或第一次进入放食物臂而不摄取食物为工作记忆错误(workingmemory error，WME)，进入不放食物臂称为参考记忆错误(reference memory error，ＲME)，两者之和为总记忆错误(total memory error，TE)当大鼠将 4 臂食物吃完或 10min钟后，实验结束，记录所需时间(TT)。

1. 5 脑组织的取材及免疫组织化学染色

八臂迷宫行为测试结束后即刻，每组大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，开胸(同时心脏取血 2ml测血浆 cort 含量)，经常规灌注固定，石蜡包埋后常规脑组织切片，片厚5μm，进行 BDNF 免疫组织化学染色(免疫组化检测试剂盒为武汉博士德公司生产)。将石蜡切片置于65℃烤箱中烤片1h，常规脱蜡，梯度酒精脱水，入3% H2O2－ 甲醇液，室温孵育 30min，然后加入 BDNF 血清第一抗体(兔 IgG，37℃孵育 1h)，0.1molPBS 洗 2min ×3，随后加入生物素标记的羊抗兔抗体37℃孵育1h;接着入ABC 液，37℃孵育 1h，DAB 呈色、苏木素轻度复染、裱片、脱水、透明、封片。

1. 6 大鼠血浆 cort 含量测试

八臂迷宫行为测试结束后即刻，灌注同时从大鼠左心房抽取2ml，将从每只大鼠抽出的2ml 血液4℃、3000r/min 离心 10min，分离血浆，转移至一新离心管，置于 －70℃低温冰箱中保存，采用常规放射免疫法测定大鼠血浆cort 含量。

1. 7 图像分析和统计学处理

根据大鼠脑立体定位图谱确定大鼠海马 CA1 的位置(图1-2)，用数码显微镜拍片，江苏捷达形态学分析软件对大鼠海马 CA1 区 BDNF 阳性神经元的表达进行分析，计数 BDNF 阳性细胞个数及面积(400 倍)。采用 SPSSl8. 0 软件进行统计分析，数据结果用 mean ± SD 表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVE)对组间差异进行统计，以 P ＜0.05 表示统计学上具有显著性差异，P ＜0.01表示统计学上具有高度显著性差异。

2 实验结果

2. 1 大鼠八臂迷宫行为学测试结果

表2 结果显示:与正常对照组比较，应激模型组大鼠完成八臂迷宫时间显著延长(P =0.002)，工作记忆错误次数(WME)及参考记忆错误次数(ＲME)均显著增多(P=0. 002，P =0. 043)，总记忆错误次数(TE)远远高于正常对照组(P =0.002);与应激模型组比较，应激运动组大鼠完成八臂迷宫时间显著缩短(P =0.021)，ＲME 及TE 均显著增多(P =0.026，P =0.032)，WME 与应激模型组大鼠比较无统计学意义(P =0.061)。

2. 2 各组大鼠血浆 cort 结果

表3 所示，与正常对照组比较，应激模型组大鼠血浆cort 含量显著增加(P = 0. 003)，增加幅度为 97% ;经过 4周跑台运动，应激运动组大鼠血浆 cort 含量显著降低(P=0. 049)，下降幅度为 27% ，提示长期跑台运动可能通过拮抗慢性应激诱导的 HPA 轴功能亢进，从而达到抗抑郁目的。跑台运动对抑郁模型大鼠学习记忆能力测试影响

2. 3 各组大鼠海马 CA1 区 BDNF 表达结果

从图2 可见海马CA1 区内分布有大量BDNF，胞浆染色，胞核不染色，神经元大小不一，呈散在分布，胞体形态多种多样呈圆形或椭圆形，有的有较长的突起。

由表3 可知:与正常对照组比较，应激模型组大鼠海马 CA1 区 BDNF 免疫阳性细胞数量及面积均显著减少(P=0. 001，P =0. 002)，降低幅度分别为44%及45%;经过4周跑台运动应激运动组大鼠海马 CA1 区 BDNF 免疫阳性细胞数量及面积均显著增加(P =0.035，P =0.024)，增加幅度分别为45%及58%。

3 讨论

3. 1 跑台运动对抑郁模型大鼠血浆 cort 含量及学习记忆能力的影响

下丘脑 －垂体 －肾上腺轴(HPA)涉及人体的多种生理功能和病理变化如情感、代谢调节、应激反应等，HPA轴功能障碍被认为是情绪障碍的核心特征。当机体感受应激源时，HPA 轴兴奋性提高，但若机体长期处于应激状态，将严重影响人体的身心健康，使机体出现抑郁症状。大量研究显示，抑郁患者血浆的促肾上腺皮质激素和皮质醇均浓度升高，而经抗抑郁治疗后随着抑郁缓解两者浓度下降。本实验得到相同结果，经过4 周慢性不可预知应激大鼠血浆 cort 水平均显著增加，可能的原因，HPA 轴自身具有分泌激素的功能，长期慢性应激可以促使下丘脑分泌 CＲH，CＲH 进一步刺激脑垂体分泌 ACTH，ACTH 刺激肾上腺皮质激素释放糖皮质激素(cort)。cort是 HPA 轴重要激素，过量的糖皮质激素能够对机体造成一定损害。研究认为，cort 是 HPA 轴重要激素之一，与绝望、焦虑情绪及认知功能有关，而且 Ulloa 等研究发现啮齿动物大脑重复注射 cort 可以引起动物抑郁样及影响神经系统的表现。Ｒyan 等通过水迷宫证实束缚及冷水应激21 天大鼠学习记忆能力显著下降。本实验通过八臂迷宫实验证实，大鼠经过4 周慢性不可预知的应激，与对照组比较，应激模型大鼠完成八臂迷宫时间显著延长，参考记忆、工作记忆错误次数及总错误次数显著增加，学习记忆能力明显下降，与以前多数学者研究结果一致。

研究表明，运动可以通过拮抗 HPA 轴功能亢进改善抑郁大鼠的学习记忆能力。我们的研究也证实了此观点，4 周跑台运动可以降低慢性应激致抑郁模型大鼠皮质醇的过度分泌，八臂迷宫实验中应激运动组大鼠完成八臂迷宫时间缩短，记忆错误次数显著减少，学习记忆能力增强。结合血浆皮质醇的实验结果，我们认为跑台运动通过拮抗HPA 轴减少大鼠皮质醇分泌可能是运动改善抑郁症大鼠空间学习记忆能力受损的机制之一。跑台运动对抑郁模型大鼠学习记忆能力测试影响

3. 2 跑台运动对抑郁模型大鼠海马 CA1 区 BDNF 表达的影响

海马是与学习记忆和情绪行为功能密切相关的重要脑区，也是应激易累及损伤的靶区，其与抑郁障碍的关系近年来受到关注，临床研究提示抑郁症患者海马表现出神经元萎缩和坏死，采用 MＲI 发现抑郁症患者双侧海马的体积明显小于正常人，并且海马萎缩的程度与抑郁症的病程成正比。而且研究证实，应激可以导致海马 CA1区域的形态学改变，可能与海马功能的损害有关。Sousa等发现不可预测的慢性应激既使大鼠海马 CAl 区锥体细胞树突总长度减少13%，大鼠学习记忆能力显著下降。

神经营养因子 BDNF 在抑郁症的发病机理中起重要作用，慢性不可预知的应激是近年来国内外应用最为广泛的抑郁动物模型之一，动物实验表明，应激可以减少海马 BDNF 的表达，而抗抑郁治疗可以阻止抑郁大鼠 BDNF水平的下降。本研究结果发现，长期慢性应激组大鼠海马 CA1 区 BDNF 表达明显减弱，同时大鼠学习记忆能力显著下降，可以推测慢性应激导致的海马 CA1 区 BDNF减少可能是大鼠学习记忆能力下降的病理机制之一。而应激运动组大鼠跑台运动4 周后海马 CA1 区 BDNF 表达明显增强，提示慢性应激大鼠经过长期跑台运动八臂迷宫成绩提高可能与海马 CA1 区 BDNF 表达增强有关。可能的原因，海马脑区是参与和调节应激的主要结构，应激刺激的信息首先作用于海马，并引起机体下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CＲH)的分泌导致 HPA 轴功能亢进，大鼠皮质醇分泌增加。研究发现，应激引起的皮质醇的分泌增多进而损害海马各个分区结构及功能和 BDNF的表达。海马 CAl 区在学习记忆中担负着尤其重要的作用，因此可以推测长期跑台运动增强慢性应激大鼠学习记忆能力主要与此运动拮抗 HPA 轴功能抗进减少 cort分泌导致海马 CAl 区 BDNF 表达增强有关。跑台运动对抑郁模型大鼠学习记忆能力测试影响