【摘要】 目的 通过观察蒙医温针对失眠模型大鼠自主活动的影响及对戊巴比妥钠致睡眠时间的影响,探讨蒙医温针的改善睡眠作用。方法 ①选用戊巴比妥钠诱导睡眠的法,取健康雄性 SD 大鼠 30 只,分为空白对照组和蒙医温针组,每组 15只,以戊巴比妥钠致眠时间为观察指标。②采用对氯苯丙氨酸致失眠大鼠模型,取健康雄性 SD 大鼠 60 只,分为空白对照组、失眠模型组、蒙医温针组和地西泮注射液组,每组 15 只,观察大鼠的自主活动和一般情况。结果 蒙医温针组戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠潜伏期与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。蒙医温针组戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠时间与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。失眠模型组、蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠造模前体重较空白对照组减轻(均 P＜0.01)。失眠模型组大鼠治疗后体重与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠体重增加,与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。失眠模型组大鼠活动时间明显高于空白对照组(P＜0.01)。蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠活动时间明显低于失眠模型组(均 P＜0.05)。失眠模型组大鼠站立次数明显高于空白对照组(P＜0.05),蒙医温针组和地西泮组大鼠站立次数明显低于失眠模型组(P＜0.05,P＜0.01)。结论 蒙医温针对大鼠有镇静作用和改善睡眠功能作用。
【关键词】 针灸疗法;蒙医;睡眠;自主活动;大鼠;失眠模型
失眠是睡眠的发生或维持障碍,影响日常生活的一类病症,属蒙医“赫依”病范畴。西医治疗本病仍存在难以根治、不同程度地产生不良反应、耐药性和依赖性等问题。通过文献记载和近年来的临床观察发现,蒙医温针对失眠症的疗效显著,同时具有无毒副反应、安全可靠等特点,其最大优势在于可以避免口服药物所致的副反应。因此,寻找适当有效的针刺干预措施是临床与实验研究的重要课题之一。本实验采用戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠的方法,观察蒙医温针对 SD 大鼠睡眠的影响,并选用对氯苯丙氨酸致失眠大鼠模型,采用旷场试验(OFT 试验),观察失眠大鼠的自主活动和一般情况,探讨蒙医温针改善睡眠的作用,现报告如下。蒙医温针对大鼠睡眠时间和自主活动的影响
 
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性SPF级SD大鼠80只,体重(180±220)g,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号 SCXK-(军)2007-004]。
1.2 主要仪器与试剂
电子天平(BS124S,赛多利斯提供);MLY-Ⅰ型蒙医疗术温针仪(内蒙古医学院蒙医药学院研制,专利号ZL201120058078.0);特制蒙医银针(0.5 mm×30 mm,内蒙古元阳中蒙医科技开发有限责任公司提供);自发活动视频分析系统(上海欣软信息科技有限公司提供);戊巴比妥钠、对氯苯丙氨酸由 sigma 提供;地西泮注射液(2 mL:10 mg)由西安利君沙制药有限责任公司提供(国药准字 H61022214)。
2 方法
2.1 蒙医温针对戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠时间的影响
2.1.1 实验分组及处理方法
取大鼠 30 只,随机分为空白对照组和蒙医温针组,每组 15 只。随机分组标号后,在室温 18℃～28℃、相对湿度 40%～50%的条件下饲养。蒙医温针组根据蒙医经典理论和临床治疗有效穴取顶会穴、赫依穴、心穴,每次取 1 个穴位。顶会穴位于两眉正中线与两耳叶上缘连线在头顶上的交叉处;赫依穴位于第 1 胸椎上凹正中;心穴位于第 7 胸椎下凹正中。将大鼠固定后,用特制银针斜刺,再接蒙医疗术温针仪,电流强度为 100 mA,温度为 40℃,留针 15 min。每日上午 8:00-11:00 进行治疗,共治疗 7 d。空白对照组每日同蒙医温针组相同方法固定 1 次,每次 15 min,连续 7 d。蒙医温针对大鼠睡眠时间和自主活动的影响
2.1.2 观察指标
两组治疗结束后给予腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg),观察两组大鼠翻正反射消失和恢复时间,以翻正反射消失至恢复的时间为睡眠持续时间,开始记录给药时间、翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间,睡眠以翻正反射消失为指标。分别计算出睡眠潜伏期和睡眠持续时间。记录大鼠腹腔注射戊巴比妥钠后至翻正反射消失时间为睡眠潜伏期,翻正反射消失至大鼠觉醒的时间为睡眠持续时间。
2.2 蒙医温针对失眠模型大鼠自主活动的影响
2.2.1 造模方法
将 PCPA(300 mg/kg)用弱碱性生理盐水(pH 值为7～8)配置成混悬液备用。失眠模型组、蒙医温针治疗组和地西泮注射液组大鼠在实验前 2 d 每日早晨 8:00开始,按1 mL/100 g 用量腹腔注射 PCPA 混悬液,每日1次,连续注射 2 d。第 1 次腹腔注射PCPA 混悬液 28～30 h 后,大鼠出现昼夜节律消失,活动明显频繁,白天也活动不停,兴奋性增高,攻击性增强,饮食及二便显著增多,鼠毛蓬乱无光泽,大便色灰白,整体观察与对照组明显不同,表明失眠模型成功。
2.2.2 实验分组及处理方法
取正常雄性 SD 大鼠 60 只,随机分为空白对照组、失眠模型组、蒙医温针治疗组和地西泮注射组,每组 15 只,正常饲养 7 d 后予以相应处理。①空白对照组不造模,于实验前连续 2 d 腹腔注射同 PCPA 用量体积的弱碱性生理盐水,第 3 天开始实验,与蒙医温针组同样方法固定 15 min,连续 7 d,其他处理同蒙医温针组。②失眠模型组造模 2 d,第 3 天开始实验,与蒙医温针组同样方法固定 15 min,连续 7 d,其他处理同蒙
医温针组。③蒙医温针组造模 2 d,第 3 天开始蒙医温针治疗,连续 7 d,针刺方法同实验 1。④地西泮注射液组实验前2 d造模,第3天开始大鼠腹腔注射地西泮注射液,0.92 mg/kg/d,每日 1 次,连续 7 d。
2.2.3 旷场试验
参照文献方法采用旷场试验方法,于失眠第7天(第 1 次腹腔注射 PCPA 后 7 d),在安静、暗光条件下检测。实验前先置大鼠 1 次单独放入 OFT-100 自发活动实验仪(箱子长宽均为 80 cm,高为 40 cm,为内空的立柱体,壁周为透明玻璃)中适应3 min后,操作者握住大鼠尾根部 1/3 处,轻轻将大鼠放入矿场箱中格内,开始同步录像计时。观察 5 min 内大鼠活动情况。取出大鼠后,用毛巾蘸清水及低浓度酒精彻底擦拭箱底,避免留有气味而干扰下 1 只大鼠的观察结果。
2.3 观察指标
①中央格停留时间(s),即自大鼠被放入正中格至其有 3 爪跨离该格的时间;②站立次数,即两前肢向上抬起离开箱底面或攀伏在侧壁上,以后腿支撑使身体竖立的次数;③水平活动时间(s),即水平面上活动的时间。蒙医温针对大鼠睡眠时间和自主活动的影响
2.4 统计学方法
所有数据采用 SPSS16.0 软件统计处理,采用两个独立样本的 t 检验和卡方检验,计量资料以均数±标准差表示,以 P＜0.05 表示差异统计学意义。
3 结果
3.1 蒙医温针对戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠时间的影响
由表 1 可见,蒙医温针组戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠潜伏期与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞·474· Shanghai JAcu-mox, May 2014, Vol 33, No 50.05)。蒙医温针组戊巴比妥钠致眠大鼠睡眠时间与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01),提示蒙医温针明显延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间。
3.2 蒙医温针对失眠模型大鼠自主活动的影响
空白对照组大鼠睡眠、饮食等方面无明显改变。失眠模型组、蒙医温针组及地西泮注射液组大鼠于第 1 次腹腔注射 PCPA 混悬液 28～30 h 后,昼夜节律消失,白天活动增多,饮水进食减少;随失眠时间的延长,大鼠疲惫、烦躁、皮毛蓬乱无泽愈加明显,对声音、光等刺激的警觉性减弱,饮食及二便增多,攻击性增强。整体观察与对照组明显不同,与文献报道一致,表明模型复制成功。至造模第 8 天,即实验当天失眠模型组大鼠仍存在上述行为改变。蒙医温针组和地西泮组大鼠在予以针刺刺激和地西泮注射后,表现为安静、活动减少等现象,睡眠时间、饮水进食、精神状态等均逐渐恢复。
3.2.1 4 组大鼠不同时间点体重比较
入组时各组大鼠体重无明显差异(P=0.202,F=1.595)。造模前,各组大鼠体重无明显差异(P=0.701,F=0.474)。各组大鼠治疗前体重间有显著性差异(P=0.000,F=11.156),失眠模型组、蒙医温针组和地西泮注射液组较空白对照组减轻(均 P＜0.01)。治疗后,失眠模型组大鼠体重与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠体重增加,与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01);蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠体重与空白对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。
3.2.2 4 组大鼠旷场实验水平活动和垂直活动参数比较
由表 3 可见,在水平活动上,失眠模型组大鼠活动时间明显高于空白对照组大鼠(P＜0.01),失眠模型组大鼠在中央格停留时间有增高的趋势,但与空白对照组大鼠比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠活动时间明显低于失眠模型组大鼠(均 P＜0.05)。在垂直活动上,失眠模型组大鼠站立次数明显高于空白对照组大鼠(P＜0.05),蒙医温针组和地西泮组大鼠站立次数明显低于失眠模型组大
鼠(P＜0.05,P＜0.01)。
4 讨论
失眠症属蒙医“身、心、语”功能紊乱而引起人体“三根”平衡失调而导致的“赫依”病。治疗的关键在于调节“三根”平衡,疏通筋脉,促使机体归于“三根七素”相对平衡状态,恢复正常生理功能。蒙医温针是集针刺效应、温热效应以及穴位特异性刺激为一体,通过抑制“赫依”,平衡“三根”的作用达到治疗失眠的目的。顶会穴、赫依穴、心穴是临床用于治疗失眠症的主要穴位。顶会穴具有安神、调神之功效,对治疗“赫依”性喑哑、神志不清、癫狂、视力减退、头晕、头痛等起主要作用;赫依穴对治疗癫狂、心悸、激荡、娅结、夜不能寐、舌苔灰白、颈项强直等赫依性疾病起主要作用;心穴位对治疗心悸、心抖、癫狂、巴达干赫依性心病、失眠、谵妄、纳呆、神志昏迷等起主要
作用。蒙医温针疗法是一种行之有效的治疗失眠的方法。本实验中用到的蒙医温针仪是结合现代电子技术研制而成,可以达到传统蒙医温针的作用,且具有操作简便、温度可调,安全等特点。睡眠时间是评测睡眠质量的重要指标。戊巴比妥钠为一种中枢神经抑制药,低剂量时主要抑制脑干网状上行激活系统,大剂量则对中枢神经系统起广泛抑制,从而出现镇静、催眠、麻醉作用,故在一定阈剂量下可致大鼠睡眠。因此选用戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠是被广泛采用的镇静催眠实验基础指标。在于观察蒙医温针与戊巴比妥钠的协同作用。以往文献对戊巴比妥钠剂量的报道不一,且大鼠自身对戊巴比妥钠的敏感性也存在差异。因此,前期实验先对戊巴比妥钠的阈剂量进行了摸索,结果致大鼠全部睡眠的戊巴比妥钠阈剂量值为 45 mg/kg。本实验结果显示,蒙医温针与戊巴比妥钠有协同作用,可延长戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠的时间(P＜0.01),提示蒙医温针具有镇静催眠的作用。行为是机体的重要功能表现之一,动物的行为是在神经、内分泌系统和运动器官的共同协调作用下形成的,其中以神经调节为主。对行为学进行评估时神经、内分泌等研究领域的重要组成部分。目前行为学评价方法有很多种,如观测大鼠的一般情况、探究行为、情绪反应、体力情况等。本实验采用旷场实验来评价失眠大鼠模型的行为学变化。旷场实验是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。本实验在失眠模型大鼠造模过程中,从大鼠一般行为观察发现,失眠后的大鼠饮食、能量消耗增加,体重下降。大鼠表现倦怠、体毛蓬乱、无光泽。在行为上,长时间失眠后的大鼠兴奋性提高,探究行为和攻击性增强,对环境刺激的警觉性和攻击性行为增加。至实验当天时(第一次腹腔注射 PCPA 后 7 d),失眠模型组大鼠仍存在上述行为异常。蒙医温针组和地西泮注射液组大鼠在予以针刺刺激和地西泮注射后,睡眠时间、精神状态、饮水进食、体重等均逐渐恢复。旷场实验的参数一般有水平运动参数、垂直运动参数和中央格停留时间。水平运动参数有跑动的距离、速度、时间等,这些参数反映动物的活动度;垂直活动指的是动物的站立、攀壁、修饰等行为,反映动物对新鲜环境的好奇程度。在旷场实验中大鼠增加在中央格停留时间,减少外周格时间,显示更少的焦虑样行
为。本实验结果显示,失眠模型组大鼠在旷场中央格停留时间高于空白对照组,显示出失眠模型组比空白对照组减少了焦虑样行为;失眠模型组大鼠活动时间和站立次数明显高于空白对照组(P＜0.01,P＜0.05),显示模型组的探索性行为增强。蒙医温针组大鼠在旷场实验中活动时间及站立次数均明显低于失眠模型组(P＜0.01,P＜0.05),旷场中央格停留时间也比模型组低,表明蒙医温针能够改善失眠所致大鼠焦虑样行为减少和探索行为和探索行为增强的异常变化。通过实验研究发现,蒙医温针改善失眠的时间、一般情况和行为学改变的作用和地西泮注射液的作用无差别,表明蒙医温针同地西泮注射液一样,可以改善失眠大鼠的行为、情绪变化,缓解大鼠的紧张程度,有镇静催眠的效果。
失眠导致的烦躁、倦怠等异常行为和情绪变化不仅影响到人的生活质量,更会影响人的认知、记忆能力。蒙医温针能延长失眠时间的同时有效调节失眠模型大鼠精神情绪行为的异常,提示蒙医温针具有改善睡眠、安神、镇静的作用,而其治疗机制还有待进一步研究。