摘要：目的 探讨鹰嘴豆异黄酮提取物(CIE)对阿尔茨海默病(AD)炎症模型大鼠记忆能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 采用脂多糖右侧海马注射制备 AD 模型，40 只 Wistar 大鼠随机分为 CIE 高、中、低剂量组(100，50，25 mg·kg-1)、模型组和对照组(生理盐水)，灌胃给药 28 d 后，采用 Y-迷宫测试大鼠的学习记忆能力，采用免疫组化法检测大鼠海马内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞白介素-6(IL-6)的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠学习记忆能力明显下降，尝试次数均明显增加(P<0.01)，TNF-α 和 IL-6 的表达水平有显著提高(P<0.01)；经过灌胃给药不同剂量的 CIE 后，与模型组相比，大鼠学习记忆的尝试次数和 TNF-α、IL-6 的表达水平有不同程度的降低，并呈现一定的剂量依赖性，特别在中、高剂量组差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结论 CIE 对 AD 模型大鼠的学习记忆能力有明显的改善作用，其作用机制Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响

可能与抑制模型大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关，进而抑制海马神经元的炎症反应。

关键词：鹰嘴豆异黄酮提取物；阿尔茨海默病；肿瘤坏死因子-α；细胞白介素-6；海马

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，其病因和发病机制十分复杂。有证据显示，在 AD 发病初期及病程进展过程中，海马的形态结构、神经病理会发生一系列的变化，并在 AD 的发病与发展中具有重要作用。中枢神经系统的炎症反应是 AD 的关键性特征之一，所涉及的多种炎性细胞因子加速了 AD 的整个病变过程，因此有研究提出，抗炎治疗可能延缓神经元退行性病变的速度，或将有利于缓解 AD 患者的症状。鹰嘴豆 Cicer arietinum L.属于豆科，味甘、性平、无毒，具有补中益气、温肾壮阳、润肺止咳等功效。有研究表明，鹰嘴豆具有广泛的药理活性，包括保护心血管、抗肿瘤、调脂等功能，这与其含有的活性成分异黄酮有着密切的关系，如芒柄花黄素、鸡豆黄素 A。更有研究显示，鹰Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响豆 异 黄 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract，CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的学习记忆能力，其作用机制与其抗氧化能力有关。而 CIE 是否能通过影响 AD 病程的炎症反应及炎症因子的表达，从而缓解 AD 的症状，国内外文献未见报道。本实验旨在观察 CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆能力的影响，并探讨其可能的机制，为抗 AD 的药物研发提供实验依据和新的研究思路。

1 材料

1.1 动物

成年 Wistar 大鼠 40 只，♂，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2012-0002，清洁级，体质量 200~250 g。

1.2 药品、试剂与仪器

CIE 为自行制备，紫外分光光度法测得异黄酮含量为 39.0%；脂多糖(Sigma 公司，批号：B5-L2880)，用生理盐水配成 5 μg·μL-1的溶液；TNF-α(批号：20130917)、IL-6(批号：20131025)、非结合多克隆兔抗体(批号：20131025)、S-P 试剂盒(批号：20130818)及 DAB 显色试剂盒(批号：20120320)均购自武汉博士德生物工程有限公司；UV-3100 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)； XR-XY1031 Y-迷宫刺激器(上海欣软信息科技有限公司)；大鼠脑立体定位仪(美国 Stoelting 公司)；JD801 图像分析仪(江苏捷达科技公司)。

2 方法

2.1 动物分组与给药

将 Wistar 大鼠，♂，随机分为 5 组：CIE 高、中、低剂量组(100，50，25 mg·kg-1)、模型组和对照组，每组 8 只，安静清洁环境下 4 只一笼饲养，温度控制在(25±1)℃，相对湿度 60%，正常饮食。造模手术后第 2 天开始，各试验组均灌胃给药进行干预，每日 1 次，模型组和对照组给予等量的生理盐水。

2.2 模型制备

采用 2%戊巴比妥钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉，将其固定于脑立体定位仪上，剪去头顶部毛发，碘酊消毒后切开皮肤，参照《大鼠脑立体定位图谱》选择右侧侧脑室为注射靶区，于前囟后 1.0 mm，中线旁开 1.6 mm 处，用柔性颅骨钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，用微量注射器缓慢自脑表面垂直进针 3.4 mm，将 5 μg·μL-1的脂

多糖溶液缓慢注入，2 min 后将注射针缓慢抽出，用骨蜡封住钻孔，缝合切口。对照组注射等量的生理盐水。

2.3 Y-迷宫学习记忆能力测试

大鼠连续灌胃给药 28 d 后，采用 Y-型迷宫测试大鼠的学习记忆能力。实验分 2 次进行，每次测试固定在上午 8：00~12：00，测试环境应保持安静，避光。第 1 次为学习能力测试：训练前，将大鼠放入 Y-迷宫自由活动适应 5 min，适应后将Ⅰ臂作为安全臂，Ⅱ、Ⅲ臂给予 60 V，0.5~0.7 mA的电刺激，持续 2 s，以大鼠被电击后一次性逃离至安全臂为正确反应，否则判定为错误反应。之后的训练将安全臂作为起始臂，将大鼠放置于安全臂 1 min 加强记忆，安全臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的顺序依次改变，其他臂再次给予电刺激，依次类推，以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠学习能力的指标。第 2次为记忆能力测试：学习能力测试后 48 h 后，以同样的方法测试，以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠记忆能力的指标。

2.4 取材方法和样品制备

在 Y-型迷宫学习记忆能力测试后，用 2%戊巴比妥钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉，麻醉后剪开胸腔，使心脏暴露，将灌流针从大鼠的左心室插入至升主动脉，剪开右心耳，并同时快速灌注 37 ℃的生理盐水至流出液清亮，然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注结束后迅速端头取脑，去除嗅球和小脑，将组织放入 4%多聚甲醛溶液中进行后固定 6 h。固定后修脑，取包含海马组织的脑区经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，切片备用，厚度为 4 μm。

2.5 大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测

大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测，按照博士德生物工程有限公司提供的免疫组化试剂盒说明书进行操作。切片制作完成后，每张切片随机观察 5 个高倍视野下的海马区域，根据 TNF-α和 IL-6 蛋白的表达，利用生物医学图像分析系统对视野进行灰度值测定并记录结果

2.6 统计学分析

计量资料以 x ± s表示，采用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析。2 组间的比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及 Dunnett’s 检验。

3 结果

3.1 CIE 对 AD 模型大鼠 Y-迷宫学习记忆能力的影响

在学习能力测试中，与对照组相比，模型组大鼠所需要的尝试次数明显增加(P<0.01)，说明造模成功的 AD 大鼠学习能力降低。而灌胃给予不同剂量的 CIE 后，尝试次数均有所下降，并呈现一定的剂量依赖性，中、高剂量组的差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。同样在记忆能力测试中，模型组大鼠所需的尝试次数明显高于对照组(P<0.01)，与模型组比较，不同剂量 CIE 组的尝试次数均有所下降，50 和 100 mg·kg-1剂量组的差异具有统计学意义(P<0.01)，且具有一定的剂量相关性。Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响

3.2 CIE 对 AD 模型大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达水平的影响

经图像分析系统测试显示，模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著低于对照组(P<0.01)，提示模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6的表达呈现强阳性；CIE 各剂量组 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相对于模型组有一定的提高，说明TNF-α 和 IL-6 的表达降低，且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结果见表 2。

4 讨论

AD 发病机制虽然复杂，但目前学界公认炎性反应在 AD 的发病过程中起着重要的作用。有国外研究显示，大量 TNF-α 等炎性细胞因子会存在AD 的神经病例过程中，异常高度表达的 TNF-α提示其可能与 AD 的发病有关。IL-6 是一种炎症性细胞因子，处于 AD 中枢神经系统炎症反应的中心位置，参与 AD 患者炎症级联反应的形成。Sokolova 等通过大量试验表明，IL-6 在 AD 患者脑组织中呈显著上调趋势，认为 IL-6 具有神经元毒性作用，参与 AD 的发病过程。与对照组相比，本研究中的模型组大鼠学习记忆的尝试次数明显增加(P<0.01)，海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著降低(P<0.01)，提示表达呈现强阳性，说明AD 模型大鼠学习记忆能力显著降低，中枢神经系统炎症反应明显，进一步证明了该模型的可靠，可以用于炎症反应介导的 AD 研究。鹰嘴豆由于富含具有较强抗氧化活性的异黄酮类化合物，近几年成为天然抗氧化剂开发的研究热点。有研究表明，CIE 可能通过抗氧化机制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆能力，而氧化应激不仅直接参与了 AD 的发病机制，更重要的是通过其连接中介效应放大了 AD 神经炎性病变的发生。本研究结果显示，CIE 各剂量组TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相对于模型组有一定的提高，提示海马内 TNF-α 和 IL-6 的表达降低，并呈现一定的剂量依赖性，且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。说明 CIE 对海马组织神经胶质细胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生有一定的抑制作用，在一定程度上阻断了 AD 模型大鼠海马内的炎症损伤，而产生一定的保护作用。然而，CIE 是通过何种机制和通路对 TNF-α、IL-6 等炎症因子起

到精准调控，需要进一步地深入研究和探讨。总之，CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆障碍有一定的改善作用，其作用机制可能与抑制大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关，并进而抑制海马神经元的炎症反应。