【摘 要】 目的: 探讨慢性应激性刺激引起的抑郁状态对大鼠海马神经元再生的影响。方法: 建立大鼠慢性应激性抑郁症模型，通过开场实验和蔗糖饮水实验观察大鼠行为学变化; 取大鼠脑冰冻切片行 Doublecortin ( DCX)免疫荧光检测海马新生神经元。结果: 慢性应激抑郁模型大鼠开场实验水平运动得分和垂直运动得分降低，蔗糖偏嗜度降低，且体重明显减轻; 免疫荧光结果显示慢性应激抑郁模型大鼠海马齿状回颗粒下层( subgranularzone SGZ) DCX 阳性细胞减少。结论: 慢性应激性刺激引起的抑郁状态下大鼠海马神经元再生能力减弱，提示海马神经元再生的损害可能参与了抑郁症的病理过程。

【关键词】 慢性应激性刺激; 抑郁症; 模型; 海马; 神经元再生

抑郁症是一种常见的情感性精神障碍，具有较高的复发率和终生患病率，但其发病机制目前尚不明确。慢性不可预知性应激性刺激( chronic un-predictable stress，CUS) 是近年来国内外用于抑郁症动物模型制作方法之一，目前被广泛运用于抑郁症的病理生理机制研究。研究表明慢性应激性刺激能引起大脑器质性损害，尤其是海马结构和功能的损害，因此可诱发抑郁症状的发生。另外，神经系统的可塑性和神经细胞顺应性的损害也参与了抑郁症的发病过程。海马作为介导应激反应的重要脑区，也是大脑可塑性极易受损的一个脑区，因而在研究抑郁症病因和发病机制中占有重要地位。

本文采用慢性不可预知性应激刺激的方法建立大鼠抑郁症模型，利用开场实验和蔗糖饮水实验观察大鼠行为学变化，同时通过免疫荧光法观察大鼠海马齿状回神经元再生，探讨慢性应激抑郁状态对大鼠海马神经元再生的影响，从而为抑郁症发病机制的研究提供实验证据。

材料和方法

1 材料

1． 1 实验动物 36 只成年 SD 雄性大鼠，SPF 级，购入时体重 200 ～ 220 g，购自南通大学动物实验中心。实验前在安静的环境下适应性饲养 1 周，大鼠每笼 4 只群养，自由摄食饮水，室温 22 ～24℃，相对湿度( 50 ±10) %，自然昼夜节律性光照。

1． 2 大鼠慢性应激抑郁模型的建立 36 只大鼠被随机分为两组: ①正常对照组 16 只: 正常饮水进食，不给任何刺激。②慢性应激模型组 20 只: 给予慢性不可预知的刺激。由于机体对单一应激原的刺激易产生耐受性，因此本实验采用多种不可预知的刺激

方式交替进行，建立大鼠慢性不可预知性应激模型。慢性应激时程共计 5 周，应激方式如下: ①食物剥夺( 禁食) ，12 h; ②禁水，12 h; ③夹尾( 距尾根1 cm 夹

闭) ，1 min; ④噪音刺激( 110 dB) ，1 h; ⑤倾斜饲养( 倾斜 45 度) ，12 h; ⑥ 通宵照明，12 h; 以上应激方式每天随机使用一种，但禁水、禁食隔开进行。

2 方法

2． 1 行为学检测 开场实验( Open-field) 所用敞箱为高 40 cm、长宽均为 80 cm 内空的立柱体，周壁为黑色，底面用白线划分为面积相等的 25 块。以动物穿越底面方块数作为水平活动( crossing) 得分，以直立次数为垂直活动( rearing) 得分。每只动物仅进行一次测定，每次 5 min。行为评定采用盲法，在安静房间内，由三名观察者进行，取三人的各指标平均值作为实验大鼠原始的行为学数据。蔗糖饮水实验步骤如下: 应激刺激结束后，让各组动物任意饮用两瓶不同的水: 其中一瓶为含 1%蔗糖的自来水、一瓶为自来水。测试下午 4∶ 00 至第二天上午 8∶ 00 自来水和蔗糖水的饮用量( 通过称饮水瓶重量) ，以蔗糖偏嗜度( saccharose preference) 表示，蔗糖偏嗜度/% = 蔗糖水饮用量/( 蔗糖水饮用量+ 自来水饮用量) ，作为衡量标准。比较不同组蔗糖偏嗜度的变化。

2． 2 免疫荧光双标检测 各组大鼠经麻醉、开胸，用生理盐水 100 ml 及 4% 多聚甲醛的 0． 1 mol/LPBS( pH 7． 2) 400 ml 经心灌注，取脑。后固定 4 h，蔗糖平衡沉底，冰冻切片机冠状切片，片厚 30 μm，从海马开始处出现收集切片，切片漂于 0． 01 mol/LPBS( pH 7． 2) 中。切片用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗，经 10%山羊血清封闭过夜。每张切片滴加小鼠抗 DCX 的单克隆抗体( 1∶ 1000，Abcam 公司) 50 μl，4℃湿盒孵育 24 h。用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗 3 遍后，

在避光条件下，每张切片滴加山羊抗小鼠第二抗体( 1∶ 50，Chemicon 公司) ，4℃湿盒孵育 24 h。在避光条件下，PBS 洗片 3 遍后，每张切片滴加 Hoechst33342 染液 50 μl( 1∶ 1500，Sigma 公司) ，室温下避光振摇30 min 后，PBS 漂洗3 遍，中性甘油封片。先后在激发光波长为 495 nm、吸收光波长为 520 nm，激发光波长为346 nm、吸收光波长为460 nm 的荧光显微镜下观察 DCX/Hoechst 阳性细胞并摄片。

2． 3 图像处理与统计学分析 拍摄的荧光照片通过 Leica Qwin plus 软件行 DCX、Hoechst 荧光双标图片的合成。在低倍视野( ×10) 下计数海马齿状回内DCX 阳性细胞，在高倍视野( × 40) 下测量 DCX 阳性细胞胞体周长和突起长度。以均数 ± 标准差( x珋 ± s)表示其数量，并采用 spss11 统计软件行单因素方差分析( one-way ANOVA) 。P ＜0． 05 为具有统计学意义。

结 果

1 大鼠行为学检测

1． 1 体重和开场行为指标比较 实验之前，两组动物在体重、水平穿越格数( Crossing) 、直立次数( Ｒea-ring) 上相比无差异( P ＞ 0． 05) 。而在 28 天之后，实验组与对照组相比，实验组体重低于对照组( P ＜0． 01) ，实验组水平穿越格数减少( P ＜ 0． 01) ; 直立次数减少( P ＜0． 01，表 l，Fig． 1) 。

2 免疫荧光双标检测

呈绿色荧光的 DCX 阳性细胞主要分布在大鼠海马齿状回颗粒下下层( SGZ) 区，胞浆和突起均显绿色。模型组大鼠 SGZ 区 DCX 阳性细胞分布稀疏，明显少于对照组 SGZ 区 DCX 阳性细胞数目。但模型组 SGZ 区多数 DCX 阳性细胞胞体较大，突起长，而对照组 SGZ 区 DCX 阳性细胞以胞体小，短突起细胞为主( Fig． 2) 。两者比较结果为模型组 DCX 阳性细胞平均胞体周长( μm) 为 201． 36 ±16． 12 高于对照组 134． 81 ±15． 45，P ＜0． 01; 模型组 DCX 阳性细胞突起平均长度为 26． 74 ±6． 33 长于对照组 14． 20± 5． 06，P ＜ 0． 01。

讨 论

在本研究中建立大鼠抑郁模型主要采用轻度、不可预见的应激性刺激长期作用于大鼠，使其产生抑郁症状，这与人类抑郁症中慢性、低水平的应激原促进疾病发生、加速疾病发展的机理相似。实验组大鼠经过 35 d 的慢性应激性刺激，与对照组相比开场活动减少，表明抑郁模型大鼠紧张程度增加、兴趣丧失和认知能力的减退。实验组大鼠对糖水适应减少反映了模型大鼠的兴趣和欲望的缺失，这也与临床抑郁症患者所表现的精神运动改变、兴趣或快感的丧失等有很大程度的相似性。从大鼠体重的变化来看，经过慢性应激后大鼠体重较对照组明显减轻，这也与临床抑郁症病人的体重变化相符合，表明本实验中大鼠抑郁症模型的制作是成功的。

目前研究认为抑郁症发生发展与神经系统可塑性损伤有关，有文献报道慢性应激可导致海马出现多种可塑性损害的表现: 海马体积减小，CA3 区锥体细胞萎缩，数目减少，齿状回颗粒细胞增生抑制，同时伴有学习、记忆和情绪反应的缺陷。在实验中，我们发现慢性应激抑郁模型大鼠海马齿状回SGZ 区 DCX 阳性细胞数减少，而且均为胞体较大，且突起长的成熟细胞，表明在 SGZ 区神经元前体细胞减少，尤其是新生神经元前体细胞数目下降明显，这可能是慢性应激状态下海马齿状回颗粒细胞增生抑制的可能机制。众所周知海马齿状回颗粒下层是成年哺乳动物脑内神经元再生的重要区域，位于SGZ 区的神经干细胞会向神经元前体细胞方向分化，新生神经元前体细胞不断成熟并逐渐迁移到颗粒层接受或投射纤维到 CA3 区。因此，位于 SGZ区的神经元前体细胞减少可能是抑郁模型大鼠 CA3区锥体细胞萎缩，数目减少的根本原因。有报道称给予抗抑郁类药物氟西汀、氟伏沙明和三环类去甲丙米嗪，使海马 CA3 区和齿状回的树突棘浓度显著增加，表现出对海马神经元的正性营养作用。表明抗抑郁药仅能改善症状而不能逆转病程，因为受到损害的海马神经元没有得到有效的补充。

一般来说，SGZ 区 DCX 阳性细胞数目下降的原因主要有三种可能: SGZ 区神经干细胞增殖抑制; 神经干细胞向神经元前体细胞分化抑制; 新生神经元前体细胞存活率下降，或者多种因素综合作用的结果。不同类型的刺激对于海马新生神经元的影响，以及其中的分子机制还有待于在今后的实验中进一步阐明，通过补充新生神经元减少慢性应激所致的海马可塑性损害将为临床治疗抑郁症以及其它应激相关性精神障碍提供新的治疗思路。